桃金娘果實花色苷提取物 對兩種假單胞菌生物被膜的抑制研究

劉永吉,范玉慧,郭紅輝

(韶關學院英東食品科學與工程學院,廣東韶關 512005)

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa(Ait.)Hassk)的果實稱崗稔,成熟后為紫黑色漿果,富含花色苷等物質[1],其花色苷主要由矢車菊啶-3-O-β-葡萄糖色素和芍藥啶-3-O-β-葡萄糖等幾種花色苷單體構成[2-3]。桃金娘果實的總花色苷含量相當于414 mg矢車菊素/100 g(以干質量計)[4],是較理想的花色苷來源。

花色苷是一類植物多酚類活性物質[5],具有抗氧化、清除自由基等生物活性?；ㄉ者@類天然酚類抗氧化物多數也具有一定的抗菌作用[6],如藍莓花色苷和葡萄皮花色苷對致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和沙門氏菌(Salmonella)均有抑制作用[7-8]。此外,藍靛果中的花色苷提取物能夠減少細菌生物被膜的形成和降低細菌在接觸面上的粘附作用[9],也有一定抑制作用。藍莓花色苷提取物能夠顯著抑制銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)生物被膜的形成和粘附作用[10]。可見,不少植物來源的花色苷對細菌生物被膜的形成具有抑制作用。

細菌的生物被膜是由多糖、蛋白和核酸等物質構成復合結構,細菌形成生物被膜后對環境、抗生素等具有更強的適應性和抵抗力。目前已確定多種食源性細菌具有形成生物被膜的能力,也能夠在食品或食品接觸面上形成生物被膜[11-12],這有利于其在食品接觸面黏附、并進一步污染食品。假單胞菌屬細菌多數能夠形成生物被膜[13],熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、莓實假單胞菌(Pseudomonasfragi)、隆德假單胞菌(Pseudomonaslundensis)等常見腐敗菌都能形成生物被膜,由其引起的食品污染風險已經引起了重視,探索針對生物被膜的植物活性抑制劑是控制生物被膜的重要途徑之一。

本研究主要以成熟的桃金娘果實為花色苷提取原料,探索其花色苷提取物對熒光假單胞菌和隆德假單胞菌生物被膜的抑制作用,為探尋抑制腐敗菌生物被膜的植物活性成分、進一步開發新的植物活性抑制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

桃金娘果 購于韶關當地市場,儲存于-20 ℃冰箱;熒光假單胞菌、隆德假單胞菌菌種 源于腐敗的冷卻豬肉,本實驗室分離鑒定后保存的菌株;胰蛋白胨大豆營養肉湯培養基(TSB) 廣東環凱微生物科技有限公司;平板計數瓊脂(PCA) 廣東環凱微生物科技有限公司;乙酸 天津市大眾試劑研發中心;結晶紫 天津市大茂化學試劑廠;甲醇 成都市科龍化工試劑廠。

LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;RE-52B型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器設備有限公司;SK3200LH型雙頻超聲波清洗儀 韶關德爾實驗儀器有限公司;Bio-Rad Imark型酶標儀 美國伯樂生命醫學產品有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化與制備 將凍存的菌種室溫解凍后用瓊脂平板劃線,將劃線平板在30 ℃下培養至出現明顯單菌落(24～36 h),取單菌落經兩次液體過夜活化(30 ℃搖床180 r/min)后,用無菌TSB稀釋至OD600 nm為0.5備用。

1.2.2 桃金娘花色苷提取物的制備 稱取100 g勻漿,加入60%乙醇250 mL,超聲波處理25 min(功率250 W,40 kHz),用布氏漏斗過濾,濾液避光存儲;殘渣重復以上步驟?；旌蟽纱螢V液,用0.22 μm的濾膜過濾,取濾液于旋轉蒸發儀50 ℃旋轉蒸發,待蒸發至體積小于15 mL左右時,停止蒸發,測定粗提物中花色苷含量,無菌水調整濃度,得到4 g/mL的桃金娘花色苷粗提物,再次過0.22 μm濾膜除菌,-18 ℃冰箱中避光凍存備用。花色苷含量(C,mg/L)的測定參考劉永吉等[10]的方法,采用pH示差法測定計算公式如下。

C=A×MW×DF×1000/(ε×l)

式中:A=[(Aλmax-A700)pH1.0-(Aλmax-A700)pH4.5];ε=26900(為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數);MW=449.2(矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量),DF為稀釋倍數。

1.2.3 肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度 用梯度稀釋法測定桃金娘花色苷粗提物的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)。所用的桃金娘花色苷粗提物的花色苷含量為4 g/mL,取稀釋好的花色苷提取物加入含有TSB培養液的96孔板中,依次稀釋到第10孔,第11孔為不含抑菌劑的空白對照,第12孔為TSB培養基空白對照,最終各孔的花色苷提取液梯度濃度分別為:2000、1500、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.75、7.85、0 mg/mL。將二次活化好的菌株稀釋至OD600 nm值為0.5,然后取2 μL接種至孔板,每株菌獨立重復接種3次。30 ℃培養24 h,觀察判斷。以明顯不長菌的每個菌的最低抑菌劑濃度為該菌的MIC。

1.2.4 最小殺菌濃度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)的測定 在MIC測定的基礎上選擇所有澄清的孔板,將其培養液進行稀釋100倍,取0.2 mL稀釋菌液平板涂布后30 ℃恒溫培培養24 h,以菌落不超過5個的最低濃度為MBC值。

1.2.5 桃金娘花色苷對生物被膜的抑制規律研究 在低于最小抑菌濃度的非抑菌濃度下(500 mg/mL)做花色苷提取物對細菌生物被膜的抑制實驗。在96孔標板中培養生物被膜。取稀釋好的菌液2 μL接入200 μL含有亞抑菌濃度花色苷提取物的TSB中,每個濃度做4個平行樣。以接菌的不含花色苷提取物的培養基作為陽性對照,以沒有接菌的空白培養基作為陰性對照。在30 ℃分別培養6、12、24 h,取出測定生物被膜的產量。

1.2.6 微孔板法測定細菌的生物被膜產量 參照文獻[14-15]將培養生物被膜后的孔板取出,小心除去未黏附的浮游菌培養液。用無菌TSB清洗孔板3次,用200 μL甲醇固定15 min,之后吸去甲醇并在空氣中晾干,加入200 μL 1%結晶紫加入結晶紫溶液染色5 min,將染液吸出,用流水清洗孔板至滴水無色為止。酶標板在空氣中晾干,加入200 μL/孔的33%乙酸進行溶解,用酶標儀測定630 nm處的吸光度,以此吸光值表示生物被膜的產量。以接菌的不含抑菌劑的培養基作為對照。

1.3 數據處理

所有實驗至少重復兩次,實驗數據用SPSS 19.0(SPSS Inc. Chicago,IL,USA)進行單因素方差分析,數據用Excel軟件處理并繪圖。

2 結果與分析

2.1 桃金娘花色苷提取物對兩種假單胞菌的MIC測定

桃金娘花色苷提取物對兩種假單胞菌的MIC測定如表1所示。結果表明,隆德假單胞菌和熒光假單胞菌對桃金娘果實花色苷提取物具有敏感性,在一定的濃度下,桃金娘花色苷提取物均能抑制兩種假單菌的增長。由表1可知,桃金娘花色苷提取物對隆德假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)為1500 mg/mL,對于熒光假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)為1000 mg/mL。相同濃度花色苷提取物對熒光假單胞菌的抑制效果比對隆德假單胞菌的抑制效果更明顯。本研究的桃金娘果實花色苷提取物對兩種假單胞菌的MIC較葡萄皮花色苷對致病菌的MIC高[7],這可能是因為不同來源的花色苷和菌種差異導致的,即使是不同產地的同一種果實的花色苷提取物對同一種細菌的抑制作用也有較大差異[16]。

表1 花色苷提取物對隆德假單胞菌和熒光假單胞菌MIC的測定結果Table 1 MIC of the anthocyanin extracts on Pse lundensis and Pse fluorescens

2.2 桃金娘花色苷提取物對兩種假單胞菌的MBC測定

桃金娘花色苷提取物對兩種假單胞菌的MBC測定結果如表2所示,花色苷提取物對隆德假單胞菌的MBC為2000 mg/mL,對熒光假單胞菌的MBC為1000 mg/mL。這進一步表明,隆德假單胞菌和熒光假單胞菌對桃金娘花色苷提取物敏感。一定濃度的桃金娘花色苷提取物對兩種假單胞菌均有殺菌抑制效果。該研究的桃金娘花色苷提取物對兩種假單胞菌的殺菌濃度高于葡萄皮花色苷對大腸桿菌(E.coli)或金黃色葡萄球菌(Saureus)的殺菌濃度[7],差異原因可能與花色苷來源和菌種差異有關,此外,花色苷的穩定性也是重要因素之一?；ㄉ赵谄嵝詶l件下更穩定,而本抑菌實驗所用的TSB培養基pH為7.3±0.2,在這種條件下花色苷的穩定性和活性受到了一定破壞和限制。

表2 花色苷提取物對兩種假單胞菌的MBC的測定結果Table 2 MBC of the anthocyanin extracts on Pse lundensis and Pse fluorescens

2.3 桃金娘花色苷提取物對隆德假單胞菌生物被膜的抑制作用

在MIC濃度下,細菌的生長繁殖受到抑制劑的抑制,這種情況下并不能很好地觀測抑制劑對細菌代謝的影響;在低于MIC的亞抑菌濃度下,細菌生長繁殖只有部分被抑制,而其代謝物的產生有明顯變化。因此,本文在亞抑菌濃度下觀測桃金娘花色苷提取物對兩種假單胞菌生物被膜的作用規律,其結果如圖1(A)和圖1(B)所示。

從生物被膜染色結果看,在12和24 h時,與對照組相比,添加500 mg/mL的桃金娘花色苷提取物能夠抑制隆德假單胞菌生物被膜的產生,減少了該菌在接觸面上的粘附量(圖1A)。從生物被膜產生量測定結果看,添加了500 mg/mL的桃金娘花色苷提取物組在12和24 h時其生物被膜的產量顯著(p<0.05)低于對照組(圖1B),在24 h時差異顯著(p<0.05)。低濃度的花色苷提取物對細菌生物被膜的抑制效果較低,這可能是因為低濃度的花色苷提取物不能有效地降低細菌在接觸面上的粘附[9]。同時,隨著時間的延長,花色苷提取物對細菌生物被膜的抑制作用減弱,還可能是部分花色苷在堿性TSB培養基中轉變成了查耳酮等物質使抑制作用減弱。本次研究中,添加250 mg/mL的桃金娘花色苷提取物在24 h對隆德假單胞菌的生物被膜沒有抑制效果,與對照相比反而增加了生物被膜的形成量,但差異不顯著。推測在花色苷作用較強的培養前期細菌密度較低,其生物被膜形成量較少,受到了花色苷的顯著抑制(圖1B,12 h);隨著花色苷抑制作用的減弱和菌密度的增加該菌產生了較多的生物被膜(圖1B,24 h),體系中的花色苷濃度低于抑制細菌生長的MIC濃度,在這種抑菌濃度下細菌的代謝受到一定抑制,但仍然能夠生長;這增加了細菌生長的困難性,但也可能刺激細菌產生更多的生物被膜來抵抗和適應這種不利條件;這是細菌借助生物被膜增強自身的適應性和抵抗性的結果[17]。類似的研究表明,部分低于MIC濃度的藍莓花色苷提取物對耐藥的銅綠假單胞菌(PseaeruginosaCI)、大腸桿菌(E.coli)的生物被膜沒有抑制作用,反而促進了生物被膜的產生量[18]。

圖1 花色苷提取物作用下隆德假單胞菌生物被膜的 結晶紫染色圖(A)和產量圖(B)Fig.1 Inhibition results of anthocyanin extracts on Pse lundensis biofilm formation(B) and bacterial adhesion on microtiter plate surface visualized by crystal violet staining(A)注:同一時點的不同字母表示不同濃度間 存在有顯著差異(p<0.05);圖2同。

2.4 桃金娘花色苷提取物對熒光假單胞菌生物被膜的抑制規律

在低于MIC的亞抑菌濃度下,桃金娘花色苷提取物對熒光假單胞菌生物被膜抑制作用如圖2(A)和圖2(B)所示。從生物被膜染色結果看,在12和24 h時,與對照組相比,添加500和250 mg/mL的桃金娘花色苷提取物能夠抑制熒光假單胞菌生物被膜的產生,降低其在接觸面上的粘附量(圖2A)。隨著培養時間的延長,各組假單胞菌生物被膜的產量逐漸增加(圖2B)。在第6 h并未觀測到500和250 mg/mL的桃金娘花色苷提取物對熒光假單胞菌生物被膜的形成有抑制作用;在第12 h,500 mg/mL桃金娘花色苷提取物抑制了熒光假單胞菌的生物被膜的形成,與對照組有顯著差異(p<0.05);24 h后,500和250 mg/mL的桃金娘花色苷提取物均能夠抑制熒光假單胞菌生物被膜的形成,與對照組有顯著差異(p<0.05)。花色苷的這種抑制作用可能是通過增強細菌的細胞膜通透性,抑制菌體對數期的生長分裂等機理實現的[19];如,大腸桿菌(E.coli)經紫甘薯花色苷處理后出現明顯的菌體變形,細胞質稀薄,質壁分離,細胞質解體并形成空泡等細胞死亡現象[20]。

圖2 花色苷提取物作用下熒光假單胞菌生物被膜的 結晶紫染色圖(A)和產量圖(B)Fig.2 Inhibition results of anthocyanin extracts on Pse fluorescens biofilm formation(B) and bacterial adhesion on microtiter plate surface visualized by crystal violet staining(A)

3 結論

本文研究了桃金娘果實花色苷提取物對隆德假單胞菌和熒光假單胞菌的抑制作用和抑菌濃度的花色苷提取物對兩種假單胞菌生物被膜的抑制效果,研究發現:桃金娘果實花色苷提取物對隆德假單胞菌和熒光假單胞菌具有一定的抑制作用,對隆德假單胞菌和熒光假單胞菌的最小抑菌濃度分別為1500與1000 mg/mL。在低于MIC的亞抑菌濃度下,500 mg/mL的桃金娘果實花色苷提取物對隆德假單胞菌和熒光假單胞菌生物被膜具有抑制效果,能夠降低兩種假單胞菌在接觸面上的粘附量。該研究為進一步研究桃金娘果實中花色苷抑制細菌生物被膜的可能性提供了基礎。