微小RNA-451調控COX- 2等細胞因子對人肝癌細胞株增殖和侵襲能力的影響△

馬松林，謝飛，葉龍，呂洋

荊門市第二人民醫院普外科，湖北 荊門448000

高復發率是影響肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者治療效果的主要因素之一。目前，有研究認為腫瘤微環鏡是導致腫瘤復發的重要因素。研究表明，HCC腫瘤微環境中環加氧酶2（cyclo-oxygenase-2，COX-2）表達過量是炎性反應的罪魁禍首[1]。近年來，有研究表明，microRNA通過調控腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移從而影響HCC的復發、轉移和預后。微小RNA-451（microRNA-451，miRNA-451）在多種腫瘤組織中的表達明顯下調，腫瘤細胞的增殖和侵襲能力明顯增強[2-4]。miRNA-451表達下調后，受其調控的巨噬細胞移動抑制因子（migration inhibition factor，MIF）表達增加，促進了腫瘤的發生和轉移[5]。本研究擬以miRNA-451為靶點，探討miRNA-451對腫瘤微環境細胞因子表達的作用，從而證明miRNA-451在抑制HCC微環境炎性遞質表達中的調控作用，為防治HCC的復發提供新的實驗室依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

正常肝細胞株L-02以及人肝細胞癌的HCCLM-3、MHCC-97H/L、Huh-7、SMMC-7721、HepG-2（惡性程度：HCCLM-3＞MHCC-97H＞MHCC-97L＞Huh-7＞SMMC-7721＞HepG-2）細胞株均由廣西醫科大學附屬腫瘤醫院捐贈。高糖DMEM培養液和胎牛血清均購自美國Gibco公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，SYBR?Premix和逆轉錄試劑盒均購自日本Takara公司，Matrigel膠購自美國BD公司，7300型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。miRNA-451反轉錄引物和RT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-451高表達細胞株構建LV-premiRNA-451慢病毒載體由上海吉凱基因化學技術有限公司構建，轉染細胞的具體步驟按照轉染試劑盒操作說明進行。

1.2.2 熒光定量RT-PCR 采用熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測MIF、MAPK、ERK、COX-2、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）mRNA和miRNA-451的相對表達量：取對數生長期的HCC細胞株，采用Trizol法提取細胞中的總RNA，取適量的總RNA進行逆轉錄，獲得的cDNA于-20℃保存。以cDNA為模板進行RTPCR。反應體系：每管總量為 20.0 μl，SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ10.0 μl，上下游引物各 0.8 μl，模板2.0 μl，滅菌蒸餾水6.4 μl；反應條件：94℃預變性1 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸5 min，共30個循環；72℃延伸10 min。以GAPDH為內參。應用2-△△Ct法計算相對表達量。實驗重復3次。引物序列詳見表1。

表1 熒光定量RT-PCR的引物序列

1.2.3 Transwell實驗 采用Transwell小室檢測細胞的侵襲和轉移能力：取對數生長期的MHCC-97H細胞株作為空白對照組，轉染LV-pre-miRNA-451的MHCC-97H細胞株作為LV-pre-miRNA-451組，應用不含血清的DMEM培養基制備成1×106/ml的細胞懸液，在Transwell上室中加入100 μl的細胞懸液（細胞侵襲實驗需要制備人工基底膜，將Matrigel膠和無血清的DMEM培養基按照1∶3的比例混合），下室加入600 μl 10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃孵育24 h后用棉簽擦去杯內細胞，在95%乙醇中固定30 min。下室細胞在吉姆薩中染色30 min。然后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞2次，于顯微鏡下計數，隨機選取5個視野，實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 平板克隆實驗 空白對照組和LV-pre-miRNA-451組細胞按200/孔分別接種于6孔板，每組設置3個復孔。37℃孵箱中培養2周后進行吉姆薩染色，同時光學顯微鏡下觀察，以≥50個細胞的細胞球作為1個克隆，并計算克隆形成率；克隆形成率＝（克隆形成數目/接種細胞總數目）×100%。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測HCC細胞株中miRNA-451的相對表達量

HCC細胞株HCCLM-3中miRNA-451的相對表達量為（0.11±0.01），MHCC-97H中miRNA-451的相對表達量為（0.23±0.01），MHCC-97L中miRNA-451的相對表達量為（0.44±0.03），Huh-7中miRNA-451的相對表達量為（0.55±0.02），SMMC-7721中miRNA-451的相對表達量為（0.74±0.03），HepG2中miRNA-451的相對表達量為（0.70±0.01），與正常肝細胞株L-02細胞比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 不同HCC細胞株miRNA-451的相對表達量

2.2 空白對照組和LV-pre-miRNA-451組miRNA-451的表達情況

轉染72 h后，LV-pre-miRNA-451組miRNA-451的相對表達量較空白對照組上調了（12.09±0.15）倍（P＜0.05）。

2.3 MHCC-97 H細胞過表達miRNA-451后對各基因表達的影響

miRNA-451過表達后，MHCC-97H中MIFmRNA的相對表達量為（0.30±0.13），MAKPmRNA的相對表達量為（0.68±0.02），ERKmRNA的相對表達量為（0.48±0.02），COX-2mRNA的相對表達量為（0.56±0.01），TGF-βmRNA的相對表達量為（0.51±0.02），VEGFmRNA的相對表達量（0.42±0.02），PGE2mRNA的相對表達量為（0.76±0.03），與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 MHCC-97 H轉染LV-pre-miRNA-451后相關基因的相對表達量

2.4 Transwell侵襲實驗

培養24 h后，LV-pre-miRNA-451組侵襲至Transwell膜背面的細胞數量為（53±5）個，明顯低于空白對照組的（79±4）個，差異有統計學意義（t=7.700，P＜0.01）。

2.5 Transwell遷移實驗

空白對照組細胞遷移至Transwell膜背面的細胞數量為（34±4）個，LV-pre-miRNA-451組細胞遷移至Transwell膜背面的細胞數量為（17±4）個，空白對照組明顯高于LV-pre-miRNA-451組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.6 平板克隆形成實驗

HCC細胞株MHCC-97H過表達miRNA-451后的平板克隆形成率為（15.7±0.5）%，明顯低于空白對照組細胞的（27.0±0.4）%，差異有統計學意義（t=31.705，P＜0.01）。

3 討論

腫瘤微環境是指腫瘤局部浸潤的免疫細胞、間質細胞及所分泌的活性介質等與腫瘤細胞共同構成的局部內環境，其在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移過程中發揮著至關重要的作用[6]。COX-2能夠導致腫瘤微環境中TGF-β、VEGF、PGE2、白細胞介素-10（IL-10）以及IL-12等因子分泌增加，促使腫瘤復發[7-9]。因此，下調COX-2的表達對于減少腫瘤的復發具有重要意義。

有研究采用了microRNA芯片技術，對術后早期肝癌復發（2年內復發）患者的癌組織和晚期復發（2年后復發）患者的癌組織進行分析，同時與正常肝組織進行比較，發現晚期復發組中癌組織中miRNA-451表達較正常肝組織下調[10]。本研究發現，在HCC細胞株中miRNA-451的表達與腫瘤的侵襲及轉移等惡性行為關系密切。miRNA-451表達下調后，受其調控的MIF表達水平升高，促進了腫瘤的發生和轉移[5]。而在腫瘤微環境的相關研究中，有研究表明MIF通過活化MAPK/ERK信號通路，最終導致COX-2表達上調，使腫瘤微環境產生炎性反應，從而導致腫瘤復發或轉移[11]。推測miRNA-451表達下調后，MIF表達水平增高，從而導致COX-2增多，腫瘤微環境產生炎性反應，導致HCC術后遠期復發。

本研究通過HCC細胞株MHCC-97H過表達miRNA-451后發現，與腫瘤微環境相關的各基因MIF、MAKP、ERK、COX-2、TGF-β、VEGF、PGE2相對于空白對照組表達均出現下調，Transwell實驗發現侵襲和遷移至Transwell膜背面的細胞數量相對于空白對照組均明顯下降（P＜0.01）；MHCC-97H過表達miRNA-451后的平板克隆形成率也明顯低于空白對照組細胞（P＜0.01）。因此，miRNA-451在HCC細胞株中的相對表達量下調，下調后可能通過活化MAPK/ERK信號通路，導致COX-2上調，并促進腫瘤微環境中炎性介質TGF-β、VEGF以及PGE2的生成和釋放，從而進一步促進腫瘤的復發和轉移。

miRNA-451是抑制HCC腫瘤微環境炎性反應的重要因子，通過阻斷MIF/MAPK/ERK通路，最終減少COX-2的相對表達量，降低腫瘤微環境中的炎性反應，從而減少腫瘤復發，為防治HCC的復發提供一種新的實驗室依據。

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