利用CODEHOP設計簡并引物并克隆玫瑰LAZY1基因片段

李政宏 ，李 勇 ，鄒 凱，李忠健 ，趙蘭勇*，徐宗大 *

（1.山東農業大學 林學院，山東 泰安 271000；2.肥城市園林綠化管理局，山東 肥城 271600）

玫瑰是重要觀賞花木，不僅被廣泛用于城鄉綠化中，而且是食品工業和香料工業的重要原料[1]。近年來，國內外學者對玫瑰的研究主要集中在花色、育種、品種分類和花期調控等方面，對玫瑰株型研究甚少。株型是園林植物的重要觀賞性狀[2]。植物的株型主要與地上部分枝角度有關，研究結果表明植物分枝和眾多因素有關，包括分子調控機制、重力響應以及光周期等[3]。隨著基因組學研究的進一步發展，調控植物分枝角度的IGT基因家族被發現，該家族包含 LAZY1、TAC1、DRO1 等基因[4-7]。 其中 LAZY1 沉默可以造成植物側枝水平生長，削弱重力反應，在玉米LAZY1突變體的研究中，突變體的根部向地性生長仍然正常，但地上部分卻完全匍匐生長，這說明LAZY1基因主要參與植物地上部分的分枝調節[8]。

以往設計簡并引物的方法都建立在大量生物信息收集的基礎上，通過比對同源性較高的氨基酸序列，找到它們共同的保守區域，再由它們的保守區域進行引物設計[9]。傳統方法需要花費大量時間去比對序列，不僅消耗很多的時間精力而且設計出來的引物往往都有著較高的簡并度。本研究通過CODEHOP在線程序設計簡并引物，以玫瑰幼莖cDNA作模板，經過RT-PCR克隆得到玫瑰LAZY1基因片段，為后續玫瑰LAZY1基因擴增和研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玫瑰匍匐品種‘平枝玫’，種植在山東農業大學南校區玫瑰種質資源圃。

1.2 方法

1.2.1 取材

2017年4 月中旬，植株長出嫩枝時，將其剪下,放入液氮，在-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 總RNA提取

參照EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒說明書，完成玫瑰幼莖總RNA的提取。

1.2.3 反轉錄合成cDNA第一鏈

參照abm公司5XAll-In-OneRTMasterMix試劑盒的使用說明書，合成cDNA，包括基因組DNA的去除。反轉錄得到的 cDNA放于-20℃保存。

1.2.4 引物設計與合成

根據在水稻、玉米、楊樹、桃樹等植物中已有的關于LAZY1基因的序列信息，使用Genebank數據庫找到五條以上LAZY1同源基因，短柄草（XM_010239413.2）、高粱（XM_002449467.2）、谷子（XM_004979233.2）、胡楊（XM_011022498.1）、毛果楊（XM_002299287.2）、木薯（XM_021774420.1）、水稻（XM_015761205.1）、桃樹（XM_007223027.2）、玉米 （NM_001138862.1）。將以上序列保存為FASTA格式，提交到blockmaker，對序列保守區進行同源查找后，得到10個保守區。將10個保守區提交到CODEHOP服務器進行簡并引物設計，各項引物設計參數為：簡并度（degeneracy）64，Tm 值 60℃，遺傳密碼“Standard”，密碼子選用框選擇和玫瑰同屬薔薇科的蘋果（malus domestica）。參數選擇完畢點擊“Look for primers”,在新界面選擇分數高的引物序列，將所選序列提交上海生物工程公司合成。

1.2.5 PCR擴增

PCR擴增LAZY1基因片段，以玫瑰幼莖RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用設計好的簡并引物進行RT-PCR擴增。本實驗采用降落PCR（touchdown PCR）程序[10-13]：94℃預變性 5min，之后進入擴增程序，94℃變性30s，62℃—50℃每降一度循環 2次，49℃循環 20次，72℃延伸 1min，共 44個循環，最后72℃延伸8min。擴增完后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。

1.2.6 產物回收、測序

用Takara DNA回收試劑盒回收擴增產物片段，與pMD18-T Vector連接后轉入大腸桿菌Trans-T1培養，之后進行菌液PCR驗證，驗證完成后將菌液送交華大基因測序。

1.2.7 PCR產物結果分析測序結果通過NCBI的數據庫進行Blast檢索，對產物片段進行序列比對和同源性分析。

2 結果與分析

2.1 簡并引物設計

從CODEHOP程序設計得到多對引物中，篩選出6條上游引物和4條下游引物 （表1）。再通過oligo分析，根據退火溫度相差小，簡并度小，所得產物片段不要太小的原則，從中選出上游引物UP1、UP3、UP6，下游引物 DW2、DW4 進行配對，組成引物組合表（表2）

2.2 RT-PCR電泳結果

由表2的引物組合進行RT-PCR，經過瓊脂糖電泳檢測后，結果B組和D組引物未擴增出條帶，A、C和E組引物擴增結果中不止一條帶，說明引物對特異性不強，F對引物擴增出一條帶，說明F對引

表1 引物篩選結果

表2 引物組合表

物特異性較好（圖1）。

圖1 PCR擴增結果

2.3 PCR產物回收和序列分析

根據凝膠電泳結果，實驗選取F組引物克隆片段進行回收，經過載體克隆測序后，得到長度為410bp的片段，將其命名為F片段。測序后的片段在Genbank中通過Blast進行比對（表3），其中 Blastn結果表明F片段與歐洲甜櫻桃 （Prunus avium）的LAZY1基因序列同源性為85%，得分為490，E value為2e-134，這說明F片段和歐洲甜櫻桃的LAZY1基因序列同源性較高。Blastx的結果顯示F片段編碼氨基酸與葡萄 （Vitis vinifera）LAZY1基因編碼氨基酸的同源性為64%，得分為156分；和Herrania umbratica中LAZY1基因編碼氨基酸的同源性為61%，比對得分為143分；和巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）中LAZY1基因編碼氨基酸的同源性為68%，比對得分為132分；和麻風樹（Jatropha curcas）中LAZY1基因編碼的氨基酸同源性為66%，比對得分為127分。通過Blast的結果，可以說明克隆片段為玫瑰LAZY1基因片段。

3 討論

為了獲取未知核酸序列，需要進行大量生物信息的收集。張磊和馬月林在克隆目的基因時，根據和研究材料親緣關系近的物種同源基因直接設計引物，這種方法只能針對那些已有轉錄組或者基因組數據的近緣物種[3,14]。當研究對象沒有基因組或轉錄組數據時，這種方法就不可行了。這時需要通過設計簡并引物，對研究對象進行同源克隆得到目的基因。

傳統的簡并引物設計建立在大量生物信息的收集上。首先大范圍搜索已知目的基因編碼的氨基酸序列，通過比對不同物種的氨基酸序列確定氨基酸保守區域，保守區域長度不能低于6個氨基酸殘基長，再根據保守區域設計簡并引物。使用這種方法設計的簡并引物簡并度往往偏大，并且簡并引物的特異性也不高，PCR出現非特異性擴增的可能性很大。同時由于密碼子的簡并性，設計出來的簡并引物退火溫度（Tm值）容易偏低，造成PCR假陽性反應，給后續研究增大人力和物力投入[15-18]。

相比于傳統簡并引物設計方法，利用CODEHOP設計簡并引物具有特異性高及靈敏性強等優點。CODEHOP方法的原理是把簡并引物設計為兩個部分，第一部分是3’簡并核心區，先比對多個同源序列得到共同的氨基酸保守區域，再從氨基酸保守區域中選取既連續又保守的3~4個氨基酸序列進行引物設計，因為是從連續保守序列開始設計的引物，所以可以保證引物設計的成功率高；另一部分為5’非簡并夾板區，這一部分是由保守氨基酸對密碼子的偏愛性原則預測所得到的最佳堿基組成。在設計簡并引物的過程中，可以通過調整3’簡并核心區的長度來達到降低簡并堿基使用量的目的。依靠5’非簡并夾板區的保守性，可以使3’簡并核心區在擴增過程中與模板結合的更穩定，并且5’非簡并夾板區也可以在不增加簡并度的同時提高引物的Tm值，這些都可以提高PCR產物擴增的特異性。當然，在擴增開始時，5’非簡并夾板區可能會和模板發生錯配，但3’核心區與模板的不適配會終止引物對與模板的配對，經過連續多輪擴增后引物的特異性匹配會大量增加，最終提高擴增的特異性和準確性。對于克隆未知基因片段是一種高效而使用的方法。

表3 F片段Blast結果

本研究利用CODEHOP在線設計簡并引物，配合降落PCR（Touchdown PCR）技術，成功克隆出玫瑰LAZY1基因片段，為后續玫瑰LAZY1基因全長的克隆奠定基礎，也為IGT基因家族中各基因的起源和演化提供參考。

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