急性髓系白血病患者miR-372的表達水平及其臨床意義

趙強強 馮建明 李文倩 沈括 陳紹斌 解友邦 趙長明 侯艷

1青海省人民醫院血液科（西寧810007）；2青海大學（西寧810016）

急性髓系白血病（AML）是一種以造血干細胞快速增殖為特征的造血干細胞惡性疾病。AML的主要特征是未成熟細胞異常積累以及正常造血細胞受到抑制［1-2］。急性髓系白血病的預后多變，從幾周生存期到完全緩解期和治愈期［3］。在成人AML患者中，5年無病生存率與年齡密切相關，其中65歲以上的患者生存率最低［4］。根據世界衛生組織對AML的分類，細胞遺傳學和分子生物學分析對于預測AML患者的緩解和生存率非常重要［5］。然而，由于AML發展的分子機制不同，AML患者的預后仍然難以準確估計。因此，鑒定新的生物標志物將有助于更好地治療AML，并更好地預測這些患者的化療反應。MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼小RNA分子，長度為18～25個核苷酸。miRNA可以通過與靶基因的3′非翻譯區結合導致靶mRNA的降解或抑制［6］。miRNAs參與多種生理和生物學功能，如增殖、分化、器官發生、胚胎發生和凋亡［7］。此外，各種疾病都表現出miRNAs的異常表達和失調，例如肺癌、腎癌和肝臟疾病［8］。在癌基因的異常激活和抑癌基因沉默的過程中，miRNAs的失調在腫瘤發生中起著重要的作用。因此，一些研究表明特異性靶向miRNAs可以成為腫瘤治療的潛在靶點［10］。而且，血漿和血清中miRNAs的表達譜被證實可以作為非侵入性的生物標記物來區分特定類型的癌癥［9］。最近的研究表明了AML患者不同組織，包括血漿中，各種miRNAs的表達譜發生異常。因此，血漿microRNA是診斷AML和評價AML患者預后的新的生物標記物［9-10］。在不同的腫瘤中，miR-372的異常表達被廣泛報道［11-12］。但是miR-372是否在急性髓系白血病患者中發生改變尚未有相關研究。本次研究主要探討miR-372在急性白血病患者的血漿中的表達情況及其參與AML發展的可能作用機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年6月至2016年5月在青海省人民醫院診治的60例急性髓系白血病（AML）患者，以及20例正常對照組的血漿樣本，診斷和分型依據法-美-英（FAB）分組和2008年WHO分組［13］。所有AML患者均為初治患者，無其他惡性腫瘤病史，未接受過抗腫瘤藥物治療。納入標準：診斷AML的外周血或骨髓原始細胞≥ 20%；伴有特殊染色體類型 AML 如 t（8；21）（q22；q22）、inv（16）（p13；q22）和 t（16；16）（p13；q22）時，即使原始細胞數＜20%，也應診斷為AML。排除標準：伴t（15；17）（q22；q12）的急性早幼粒細胞白血病；MDS或MPD轉化而來的AML；治療相關AML。60例AML患者均經過骨髓形態學、白血病免疫分型、細胞遺傳學及分子生物學等檢查確診，分型：M0 2例、M1 20例、M2 23例、M4 9例、M5 5例、M7 1例。20例正常對照組來自健康志愿者，其標本采集均獲得知情同意及醫院倫理委員會批準。AML患者及正常對照組臨床資料見表1。

表1 AML患者及正常對照臨床資料Tab.1 Clinical data of AML patients and normal controls

1.2 血漿miRNA檢測 500 μL血漿中的總RNA通過miRNeasy提取試劑盒（Cat No.217184，Qiagen，CA，USA）進行分離，然后用50 μL的DEPC水進行溶解。提取的RNA用Nano-Drop ND-1000吸光光度計（Thermo Fisher scientific，Waltham，USA）進行純度檢測。

之后，RNA進一步用miScriptⅡ反轉錄試劑盒（Cat No.218161，Qiagen，CA，USA）進行反轉錄。實時定量PCR被用來進一步確定血漿中miR-372的相對含量。具體反應體系及程序如下：cDNA模板（2 μL），SYBER Green Master Mix（5 μL，Cat No.218073，Qiagen，CA，USA），前向引物（1 μL），反向引物（1 μL），ddH2O（1 μL）；95 ℃ 15 min，94 ℃15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s（40 ×）。U6做為內源性對照，使用 2-ΔΔ（Ct）方法檢測 miR-372 的相對含量。

1.3 293 T細胞培養 HL-60細胞及293T細胞（購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心）用含10%胎牛血清的L-DMEM培養基、于37℃、含5%CO2的培養箱中孵育。每2天更換培養液1次，細胞達70%～80%豐度時，傳代或用于實驗。

1.4 靶基因預測 使用生物信息學軟件Target Scan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）預測 miR-372的靶基因。

1.5 293 T細胞中pmirGLO-PTEN重組質粒的轉染 將包含結合位點的PTEN的3′UTR區域克隆到雙熒光素酶報告基因質粒pmirGLO中。將293T細胞種于6孔板中，待細胞80%融合后，按說明書分別稀釋pmirGLO-PTEN以及empty-pmirGLO，按HiPerFect（QIAGEN）轉染試劑試劑盒說明書進行轉染。

1.6 雙熒光素酶報告系統檢測 將培養基倒掉，并用1×PBS沖洗細胞3次，棄掉PBS，在6孔板的毎孔中加入1×被動細胞裂解液（PLB），在室溫中震蕩15 min，并將裂解液轉入1個EP管中。取100 μL熒光素酶分析底物（LARⅡ）加入反應管中，然后加入20 μL細胞裂解液，待熒光分光光度計讀數結束后，再加入100 μL Stop&Glo Buffer。計算相對熒光強度，并與空載對照比較。

1.7 劃痕實驗 將HL-60細胞以106cells/well接種于6孔板，24 h后，用槍頭在孔中均勻劃出2條距離相同的橫線，并刮掉中間的所有細胞。用PBS清洗3次，加入新鮮培養基。之后，將miR-372 inhibitor或者對照NC轉染進入HL-60細胞，48 h后，觀察細胞遷移情況。轉染方法按HiPerFect（QIAGEN）轉染試劑試劑盒說明書進行轉染。

1.8 克隆形成能力檢測 取對數生長期的HL-60細胞，用0.25%的胰蛋白酶吹打成單細胞，以50細胞/孔的密度接種于6孔板。在孵箱中輕輕轉動使細胞分散，2周后，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，棄去上清，PBS洗2次。之后將細胞用4%多聚甲醛固定15 min。然后用1 mL GIMSA染色液染20 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。肉眼直接計數，克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.9 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理。計量資料以±s表示。連續性計量資料采用單因素方差分析進行多組比較，非連續性計量資料采用秩和檢驗進行多組間比較。ROC曲線分析miR-372是否可以區分AML患者與健康對照。95%可信區間，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-372在急性髓系白血病患者外周血中水平明顯升高 本研究對健康對照組和急性髓系白血病患者外周血中的miR-372水平進行了Real time PCR檢測。與健康對照組相比，急性髓系白血病患者外周血中miR-372水平顯著升高。

圖1 急性髓系白血病患者外周血中miR-372水平明顯升高Fig.1 MiR-372 levels in peripheral blood of patients with acute myeloid leukemia are significantly elevated

2.2 ROC曲線分析 受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析表明miR-372可以區分急性髓系白血病患者與健康對照組，曲線下面積為0.912（95%置信區間：0.819～1.000；P＜0.000 1）。

2.3 PTEN是miR-372的靶基因 TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）生物信息學軟件預測結果發現在PTEN的3′非翻譯區有6個保守的結合位點（圖3A）。雙熒光素酶報告基因表明，過表達miR-372可以顯著抑制pmirGLO-PTEN-3′UTR-1，pmirGLO-PTEN-3′UTR-2，pmirGLO-PTEN-3′UTR-3（包含結合位點3和4），pmirGLO-PTEN-3′UTR-4（包含結合位點5和6）（圖3B）。蛋白質免疫印跡檢測表明，過表達miR-372可以抑制PTEN的表達，而抑制miR-372可以促進PTEN的表達（圖3C和3D）。

圖2 ROC曲線分析表明miR-372可以區分急性髓系白血病患者與健康對照Fig.2 ROC curve analysis shows that miR-372 can distinguish patients with acute myeloid leukemia from healthy controls

2.4 敲低miR-372抑制HL-60細胞遷移 本研究在HL-60細胞中轉染了miR-372 inhibitor。結果表明，在HL-60細胞中敲低miR-372可以顯著降低HL-60的細胞遷移率（圖4）。

2.5 敲低miR-372抑制HL-60細胞克隆形成能力 本研究還證實在HL-60細胞中敲低miR-372可以顯著抑制HL-60細胞的克隆形成能力（圖5）。

3 討論

在早期急性髓系白血病患者中，早期診斷和及時治療可以有效提高患者的生存率［14-15］。因此，積極尋找診斷和治療急性髓系白血病的新的生物學標志物對于有效診斷和治療具有十分重要的意義［16］。在不同的腫瘤和組織，miRNA表達譜的改變被廣泛發現。活檢樣本中，進一步分析miRNA的表達，發現這些miRNA表達的異常改變與腫瘤的浸潤和轉移密切相關［17］。在循環系統中，如血漿、血清、尿液中，miRNA可以穩定存在［17］。因此，越來越多的研究致力于探討miRNA是否可以成為腫瘤發生發展的非侵入性生物學標志物。

本研究重點探討了外周血中的miR-372是否與急性髓系白血病的發展密切相關。與健康對照組相比，急性髓系白血病患者血漿中miR-372的水平明顯增加。ROC曲線分析表明miR-372可以區分急性髓系白血病患者與健康對照。這些結果初步表明，血漿miR-372在急性髓系白血病的發展中以致癌基因的形式發揮作用。

圖3 PTEN是miR-372的靶基因Fig.3 PTEN is the target gene for miR-372

圖4 在HL-60細胞中敲低miR-372可以顯著降低HL-60的細胞遷移率Fig.4 Knockdown of miR-372 in HL-60 cells can significantly reduce the cell migration of HL-60

圖5 在HL-60細胞中敲低miR-372可以顯著抑制HL-60細胞的克隆形成能力。Fig.5 Knockdown of miR-372 in HL-60 cells significantly inhibited the colony forming ability of HL-60 cells

在不同的腫瘤中，miR-372的異常表達被廣泛報道［11-12］。例如，miR-372表達上調與口腔癌的淋巴結轉移正相關［11］。而在肝癌腫瘤轉移中，miR-372的水平顯著降低［12］。考慮到miR-372可能的致癌作用，筆者進一步分析了其相關靶基因。Tar-getScan預測分析的結果表明，PTEN的3′非翻譯區存在4個可能的保守結合位點。眾所周知，PTEN是一個十分重要的抑癌基因。因此，我們將這幾個不同位點的3′UTR區克隆到雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO中。雙熒光素酶報告基因及Western blot的結果均表明，PTEN是miR-372的靶基因。因此，我們推測，急性髓系白血病患者血漿中miR-372的升高，可以通過抑制PTEN的表達，進而導致腫瘤的惡性侵襲和轉移。

基于以上推測，筆者進一步在急性髓系白血病細胞HL-60中敲低了miR-372的表達，從而觀察其對HL-60細胞遷移和克隆形成能力的影響。本研究結果表明，在HL-60細胞中抑制miR-372可以有效抑制細胞的遷移和克隆形成能力。提示miR-372可能成為急性髓系白血病治療的一個新的潛在靶點。

但是，本研究仍然存在一些缺陷。首先，本研究中所采用的樣本數目相對較少。其次，在惡性程度不同的急性髓系白血病患者血漿中，miR-372的水平如何變化仍然需要進一步的探討。

綜上，本研究首次發現，在急性髓系白血病患者血漿中，miR-372水平顯著升高。通過靶向抑癌基因PTEN，miR-372可能成為一個潛在的篩查和診斷急性髓系白血病的非侵入性生物學標志物。

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