急性白血病β-catenin與LEF1基因表達的相關性

王巍 劉文鑫 黃永彬 洪運廣 楊志剛

1廣東醫科大學附屬醫院血液病研究室（廣東湛江 524000）；2上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院血液科實驗室（上海 200437）

Wnt/β-catenin信號通路是一條在進化中較為保守的通路，該通路活化后通過關鍵分子β-catenin與核內轉錄因子TCF/LEF（T cell factor/Lymphoid enhancer factor）結合形成轉錄復合體、調控下游靶基因表達而發揮生物學作用，其異常激活與多種腫瘤包括急性白血?。╝cute leukemia，AL）發病相關［1-5］。脊椎動物基因組一般都含有4種TCF/LEF，即LEF1、TCF1、TCF3和TCF4，其中LEF1與白血病發生發展的關系較為密切［6-9］。為研究Wnt/β-catenin信號通路是否通過β-catenin/LEF1轉錄復合體在AL發病中發揮作用，本文檢測了AL患者β-catenin和LEF1的表達并分析了相關性，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料及細胞株 收集廣東醫科大學附屬醫院血液科2016年3月至2017年3月初診AL患者骨髓標本85例，其中男56例、女29例，中位年齡39歲（10～79歲）。急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）62例，其中 M1 2例、M2 10例、M3 13例、M4 5例、M5 28例、M6 1例、AML未定型3例；急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）23例，其中 B-ALL 20例，T-ALL 3例，診斷符合張之南主編的《血液病診斷及療效標準》（第3版）。對照組20例為同期診治的非惡性血液病患者及造血干細胞移植供著（增生性貧血9例，原發免疫性血小板減少癥5例，感染性骨髓像3例，移植供著3例），其中男9例，女11例，中位年齡37.5歲（14～65歲）。人白血病細胞株K562、HL-60、Raji為廣東醫科大學附屬醫院血液病研究室保存，THP-1細胞由廣東醫科大學附屬醫院消化內科全娟花博士饋贈。

1.2 主要試劑 淋巴細胞分離液購置天津灝洋生物公司；TRIzol、逆轉錄試劑盒、SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 骨髓單個核細胞分離及實時定量RT-PCR取抗凝骨髓液2～5 mL，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，1×107細胞加1 mL TRIzol吹打混勻，提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA質量和濃度，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄cDNA。PCR引物用在線軟件primer 3設計好后由英濰捷基公司合成，β-catenin及內參基因GAPDH引物序列同前［11］，LEF1上游引物：5′-AGGCCTCTACAACAAGGGAC-3′，下游引物：5′-TCCTGGAGAAAAGTGCTCGT-3′，擴增片段長度208 bp。按TaKaRa公司SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行PCR 反應，總體系 10 μL，其中 SYBR@Premix Ex TaqⅡ（2×）5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 1 μL，滅菌超純水3.2 μL。PCR擴增條件：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共45個循環；之后進行熔解曲線分析。計算2-ΔCT值作為各標本mRNA相對表達量，ΔCT=目的基因CT值-內參基因CT值。

1.4 細胞培養 K562、HL-60、THP-1、Raji細胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養，待細胞呈對數生長時，取1×107細胞加1 mL TRIzol提取RNA并逆轉錄，定量PCR檢測β-catenin及LEF1表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。細胞株檢測結果用均數±標準差表示；病例標本檢測結果不符合正態分布，用中位數表示，組間比較用Mann-WhitneyU檢驗，相關性分析用Spearman相關。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA質量及方法可靠性分析 所提RNA經分光光度計檢測，A260nm/A280nm值均在1.8～2.0之間，純度好，可用于定量PCR檢測。熔解曲線分析顯示，各基因PCR擴增產物熔解溫度均一，熔解峰為銳利的單一峰，說明擴增產物均一，無非特異擴增及引物二聚體（圖1）。

圖1 β-catenin、LEF1及GAPDH PCR反應熔解曲線Fig.1 Resolving curves of β-catenin，LEF1 and GAPDH PCR products

2.2 AL患者β-catenin、LEF1 mRNA表達及相關性 β-catenin和LEF1在AML、ALL及對照組均可檢測到表達，β-catenin mRNA表達由高到低依次為ALL、AML和對照組，其中ALL與對照組、AML與對照組相比，差異具有統計學意義（Z=-3.008，P=0.003；Z=-2.333，P=0.020），ALL與AML之間差異無統計學意義（Z=-1.746，P=0.081）。LEF1 mRNA表達由高到低的依次為ALL、對照組和AML，ALL與對照組、AML與對照組、ALL與AML差異均有統計學意義（Z=-5.430，P=0.000；Z=-3.191，P=0.001；Z=-6.781，P=0.000）（表1）。Spearman相關分析顯示，ALL、AML組β-catenin與LEF1 mRNA表達均呈正相關（r=0.526，P=0.010；r=0.420，P=0.001）。

2.3 AL細胞株β-catenin、LEF1 mRNA表達 三種AML細胞株，THP-1細胞β-catenin mRNA表達最高，LEF1表達最低；K562細胞β-catenin mRNA表達最低，LEF1表達最高；HL60細胞β-catenin、LEF1 mRNA表達介于前兩種細胞株之間。THP-1細胞β-catenin、LEF1 mRNA表達方向基本與AML患者一致，可作為研究Wnt/β-catenin信號通路的AML細胞模型。Raji細胞與AML細胞株相比βcatenin mRNA表達最低，LEF1表達也最低，基本檢測不到。Raji細胞株β-catenin、LEF1 mRNA表達方向與ALL患者不同，不宜作為研究Wnt/βcatenin信號通路的ALL細胞模型（表1）。

3 討論

Wnt通路是一條在進化中較為保守的信號通路，分為經典的Wnt/β-catenin通路、非經典的Wnt/Ca2+和Wnt/PAP（planar cell polarity，平面細胞極性）通路，其中Wnt/β-catenin信號通路研究較多。Wnt/β-catenin通路簡單地說由胞外因子（Wnt蛋白）、跨膜受體（frizzled蛋白和LRP5/6）、胞內蛋白復合體（APC、Axin、GSK-3β、CK1、β-catenin等）、核內轉錄因子（TCF/LEF）、下游靶基因等組成，其中β-catenin是關鍵分子、TCF/LEF是轉錄調控開關。Wnt/β-catenin信號通路活化后β-catenin降解減少，胞漿中增多的β-catenin進入細胞核，與核內轉錄因子TCF/LEF結合形成轉錄復合體、調控下游靶基因轉錄而發揮該通路的調控作用。

表1 β-catenin和LEF1 mRNA在AL、對照組和細胞株中的表達Tab.1 Expressions of β-catenin and LEF1 mRNA in AL groups，control group and cell lines

TCF/LEF家族中LEF1參與淋巴細胞分化［10-11］、粒系發育［12］，與白血病發生發展關系較密切，比如過表達LEF1基因的小鼠可發展成為B-ALL或免疫球蛋白重鏈D-J重排的AML［7］，成人B-ALL患者高表達 LEF1預后不良［8］，正常核型AML患者LEF1高表達預后良好［9］等。急性白血病存在Wnt/β-catenin信號通路的異常激活［13-14］，該通路激活后β-catenin是否與LEF1結合發揮致白血病作用呢？為研究該問題，本文檢測了AL患者β-catenin和LEF1的表達及相關性。結果顯示，ALL患者βcatenin、LEF1 mRNA表達高于對照組，并且兩者表達呈正相關，提示β-catenin/LEF1轉錄復合體可能在ALL發病中發揮作用。而AML則不然，與對照組相比，β-catenin mRNA表達增高，LEF1 mRNA表達降低，兩個基因表達方向雖不同，但相關分析顯示仍呈正相關。ALL患者LEF mRNA表達上調與JIA等［15］的研究結果一致。AML患者表達下調與GANDILLET等［16］的研究結果基本一致，該研究用qPCR方法檢測了7例β-catenin表達較豐富的AML患者84個Wnt/β-catenin通路相關基因，與正常骨髓CD34+細胞相比，AML患者LEF1 mRNA表達下調。而FU等［17］的研究結果則相反，該研究比較了101例AML患者和20例健康對照LEF1 mRNA表達，顯示AML患者高于對照組。METZELER等［9］、ALBANO等［18］分別研究了LEF1 mRNA表達對正常核型AML、急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）患者預后的影響，但均未與對照組比較（未設對照）。目前LEF1在AL中表達研究還較少，而且本實驗、GANDILLET 等［16］和FU等［17］所設置的對照不同，依次為非惡性血液病和移植供著、正常骨髓CD34+細胞、健康人，因此LEF1在AML中的表達是上調還是下調尚難下定論。LEF1至少有2種剪接體，一種為全長型，具有轉錄激活作用；另一種為截短型（缺乏β-catenin結合位點），對轉錄具有抑制作用［7］。本實驗PCR檢測的是總LEF mRNA，FU等［17］未標明檢測的轉錄本，METZELER 等［9］和 ALBANO 等［18］檢測的也是總LEF mRNA，因此LEF1在AML患者表達研究還需增加全長型LEF檢測更準確地進行。另外，本研究結果還顯示THP-1細胞β-catenin、LEF1 mRNA表達方向基本與AML患者一致，可作為研究Wnt/β-catenin信號通路的AML細胞模型。

綜上所述，AL患者有Wnt/β-catenin路通的異常激活，β-catenin/LEF1轉錄復合體可能在ALL發病中發揮作用，LEF1在AML中的表達還需擴大樣本量、增加全長型LEF1檢測、規范對照設置進一步研究。

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