重組人促紅細胞生成素對成年大鼠脊髓中央管膜下神經干細胞增殖能力的影響

周瀟齊 吳波 嚴鑫平 朱美松 彭延凱 陳仲

1南方醫科大學珠江醫院脊柱外科（廣州 510280）；2湖北省荊州市第一人民醫院骨科（湖北荊州434008）；3廈門大學附屬東南醫院骨科中心（福建漳州 363000）；南方醫科大學珠江醫院關節骨病外科（廣州 510280）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱外科常見疾病之一，對患者的身體機能造成嚴重傷害，并帶來巨大的個人和社會經濟負擔［1］，其傷后神經功能修復問題仍是世界性難題。神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是一種具有自我更新能力、多潛能分化和增殖能力的干細胞，大量研究表明神經干細胞移植治療對于許多動物急性脊髓損傷模型有一定療效［2-3］。脊髓中央管膜下NSCs是位于脊髓內的NSCs，主要存在于脊髓中央管的室周區域。相較于間充質干細胞及嗅鞘細胞干細胞等其他來源NSCs，脊髓中央管膜下NSCs與脊髓神經組織的組織特異性更接近，而且比胚胎干細胞、誘導多能干細胞等干細胞成瘤性更低［4］。因而，脊髓中央管膜下NSCs可能是細胞移植治療急性脊髓損傷的潛在理想細胞。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種主要由胎兒肝臟和成人腎臟分泌的糖蛋白細胞因子，其功能主要為調節紅細胞生成。近來，EPO的神經保護作用得到廣泛關注，本課題組之前的研究［5］也發現延遲應用人重組促紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）治療急性脊髓損傷SD大鼠可有效改善損傷區域炎癥、減少受損細胞凋亡、促進髓鞘再生，并促進受傷大鼠功能恢復。WANG等［6］用EPO處理體外培養的新生鼠NSCs，發現可以通過減少細胞凋亡、調節細胞周期等機制提高神經干細胞的生存率并促進細胞增殖。據筆者所知，目前關于EPO對成年脊髓源神經干細胞生存、增殖等影響的研究尚未有報道。本實驗擬通過比較不同濃度EPO培養成年大鼠脊髓中央管膜下NSCs后各時間點的OD值，探討EPO影響成年大鼠脊髓中央管室膜下NSCs體外培養增殖能力的適宜濃度和處理時間長度，為臨床脊髓損傷的細胞治療提供實驗室理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，SPF級，6～8周齡，體質量（270±10）g，由南方醫科大學動物實驗中心提供。重組人促紅素注射液購于山東科興生物制品有限公司；木瓜蛋白分離酶試劑盒購于Worthington Biochemicals公司；DMEM/F12（1∶1）培養基、Neurobasal-A培養基、B27、左旋多聚賴氨酸、左旋谷氨酸、P/S雙抗均購自Gibco公司；戊巴比妥納、右旋葡萄糖、NaHCO3、HEPES、胰島素、去鐵轉鐵蛋白、腐胺、硒、孕酮、肝素、表皮生長因子（epidermalgrowth factor，EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、多聚賴氨酸、Hoechst33342均購自Sigma公司；小鼠抗巢蛋白（Nestin）抗體購于Cell Signaling Technology公司；山羊抗Sox2抗體均購自Santa Cruz公司；驢抗小鼠IgG/DyLight594、驢抗山羊IgG/DyLight488均購自EarthOx公司；CCK8試劑購于同仁化學研究所；TRIzol Reagent購于北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒購于上海星漢生物科技有限公司；熒光定量PCR檢測試劑盒購于美國Gene Copoeia公司；96孔板購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 脊髓源性NSCs的分離、消化、體外培養

1.2.1 .1 脊髓源性NSCs的分離 6～8周齡SD雄性大鼠，腹腔注射1 mL戊巴比妥鈉（65 mg/mL）處死，將頭部以下置于75%酒精中浸泡5 min消毒。消毒后在無菌條件下于下肢水平剪開相應節段背部皮膚，剝離背部肌肉，用椎板摘除術依次暴露并取出腰、胸、頸脊髓組織，于外科顯微鏡下剝離組織表面的血管、脊膜及灰質、白質，留下小部分灰質及脊髓中央管膜組織，顯微剪剪碎至1 mm3大小。

1.2.1 .2 脊髓源性NSCs的消化 將修剪后的組織塊放入3.5 mL木瓜酶分解酶混合液（含20 U/mL木瓜蛋白分解酶、0.005%脫氧核糖核酸酶Ⅰ、1 mmol/L半胱氨酸、0.5 mmol/L EDTA的EBSS溶液）中，于恒溫搖床37℃下消化1 h。消化結束后，吸取上懸浮液于300g常溫下離心5 min。離心完成后，棄上清液，用2.7 mL卵類黏蛋白酶抑制劑溶液（含10 mg/mL卵類黏蛋白酶抑制劑、10 mg/mL清蛋白的EBSS溶液）和300 μL的脫氧核糖核酸酶Ⅰ溶液（含0.005%脫氧核糖核酸酶Ⅰ的EBSS）混合后重懸沉淀。緩慢地將懸液加在5 mL卵類黏蛋白酶抑制劑溶液表面上，于70g常溫下離心6 min后棄上清獲得沉淀細胞。

1.2.1 .3 脊髓源性NSCs體外培養 用EFH培養基（含86%Neurobasal-A培養基，10%hormone混合液，1%L-谷氨酰胺，1%P/S，2%B27，20 ng/mL表皮生長因子，20 ng/mL成纖維細胞生長因子，2 μg/mL肝素；hormone混合液由含0.6%葡萄糖，3 mmol/L NaHCO3，5 mmol/L HEPES，25 μg/mL 胰島素，100 μg/mL去鐵轉鐵蛋白，10 μmol/L腐胺，30 nmol/L硒，20 nmol/L孕酮的DMEM/F12組成）重懸沉淀細胞，37℃、5%CO2培養箱培養，根據鏡下所觀察的細胞生長情況，每隔3～4 d離心、換液1次，6～8 d離心、吹打傳代1次。

1.2.2 脊髓源性NSCs的Nestin、Sox-2免疫熒光染色鑒定 將第3代脊髓中央管室膜下NSCs部分神經球接種到多聚賴氨酸（濃度為0.1 mg/mL）處理的蓋玻片上，繼續培養15 min（神經球），4%多聚甲醛固定15 min后，PBS洗3遍（5 min×3），0.2%Triton X-100室溫處理15 min，PBS洗3遍（5 min×3），1%BSA常溫封閉1 h，加入小鼠抗Nestin一抗（1∶300）和山羊抗Sox2一抗（1∶50），冰箱4℃過夜。次日用PBS洗3遍（5 min×3），加入DyLight594標記-驢抗小鼠二抗（1∶100）和DyLight488標記驢抗山羊二抗（1∶100），常溫避光孵育1.5 h，PBS洗3遍（5 min× 3），染核染料 Hoechst（1∶1 000）室溫5 min，PBS洗3遍（5 min×3），抗淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，照相。

1.2.3 CCK8細胞增殖檢測 取對數生長期的NSCs接種于每孔含有100 μL EFH培養基的96孔板中，每孔的細胞數量約為2 000個左右，且于細胞接種前向EFH中添加不同濃度EPO，使EPO的終濃度為10、20、40 U/mL，另設不加EPO（0 U/mL）的對照組，每組5個復孔，于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中靜置培養24、48、72、96、120 h后，每孔加入10 μL CCK8試劑培養4 h。CCK8孵育完畢后于酶標儀上測定450 nm吸光度，每組實驗重復3次。

1.2.4 細胞計數檢測 NSCs以1×103/mL的密度接種于每孔含2 mL體積EFH培養基的12孔板中，且于細胞接種前向EFH中添加不同濃度EPO，使EPO的終濃度為0 U/mL（對照組）、10 U/mL、20 U/mL、40 U/mL，每組3個復孔。于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養4 d后，將12孔板中的神經干細胞收集到15 mL離心管中，300g常溫下離心5 min。離心完畢后，用1 mL EFH培養基重懸沉淀細胞，并輕輕吹打，制成單細胞懸液。用111 μL 0.4%臺盼藍溶液與懸液充分混合后，吸取20 μL混合懸液，加入到計數板中，利用自動細胞計數儀計數。讀取結果，計算細胞濃度后，對比各濃度EPO組的神經干細胞數量，每組實驗重復3次。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 Trizol試劑提取各濃度EPO處理4 d后的NSCs中總RNA，分光光度計測定其濃度和純度，逆轉錄試劑盒合成cDNA，廣州四和生物科技有限公司根據Gene Bank序列合成引物序列，CyclinD1：（F）5′-AACTACCTGGACCGTTTCTTG-3′，（R）5′-GGGAATGGTCTCCTTCATCTTAG-3′，108 bp；GAPDH：（F）5′-CATCTCCCTCACAATTCCATCC-3′，（R）5′-GAGGGTGCAGCGAACTTTAT-3′，100 bp。反應體系為：2× All-in-One qPCR Mix 10.0 μL，PCR forward primer（2 μmol/L）2.0 μL，PCR reverse primer（2 μmol/L）2.0 μL，cDNA 2.0 μL，50 × Rox Reference Dye，0.4 μL，ddH2O 3.6 μL。

反應條件為初試變性95℃10 min 1次后，95℃ 10 s、55℃ 20 s、72℃ 35 s共40個循環，以2-△△Ct表示mRNA的相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件（IBM公司）進行數據處理，實驗結果計量資料以x±s表示。組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），當P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察NSCs生長 原代脊髓中央管室膜下NSCs鏡下呈單細胞散在懸浮生長，培養箱內37℃、5%CO2條件下靜止培養1周后細胞逐漸聚集生長形成體積大小不均一、不規則圓形類神經球（圖1A）。原代NSCs傳代后培養箱內培養1周，神經干細胞聚集形成規則圓形、直徑約為100 μm的神經球（圖1B）。傳至第3代后，神經干細胞開始穩定形成大量懸浮生長、大小均一的神經球。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察NSCs生長情況Fig.1 The primary culture of NSCs derived from adult SD rats

2.2 免疫熒光染色鑒定結果 免疫熒光染色見NSCs可以穩定表達神經前體細胞標志蛋白Nestin（圖2A）及干細胞轉錄因子Sox2（圖2B），同時核染色可見Hoechst標記（圖2C）。

2.3 EPO處理NSCs后行CCK8檢測450 nm處OD值 各濃度EPO處理組OD值在各時間點均高于對照組，但僅有20 U/mL處理組的OD值在72 h（P＜0.05）和96 h（P＜0.001）兩個時間點與對照組比較差異有統計學意義，且處理時間達96 h時有顯著差異（P＜0.001）。見圖3。

2.4 細胞計數 10、20、40處理組細胞數量均高于對照組（0 U/mL），且只有20 U/mL與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖4。

2.5 熒光定量PCR 10 U/mL、20 U/mL兩組Cyclin D1 mRNA表達高于對照組（0 U/mL）。其中10 U/mL與對照組有統計學差異（P＜0.01），20 U/mL與對照組有統計學差異（P＜0.001）。見圖5。

3 討論

脊髓損傷是一種十分嚴重的致殘性損傷，世界各國和地區的脊髓損傷發病率基本相同，年發病率大概為（30 ～ 40）/1 000 000［7］，且呈逐年上升趨勢。自REYNOLDS等［8］從鼠的神經組織中提取出了具有分化潛能的神經干細胞，脊髓損傷的治療開始走上了神經干細胞治療的道路。根據JAIN等［9］的一項對美國1993-2012年脊髓損傷流行病學的研究調查，脊髓損傷患者年齡構成仍以老年人和成人為主，因而成年脊髓源性NSCs相較于胎源性或新生鼠源性脊髓NSCs用于移植治療脊髓損傷的臨床意義可能更大。在移植細胞時提高移植細胞數量越大時，取得的療效也會相對更好［10］，其原因可能為受損區域中存活下來的移植神經干細胞數量也會相對變多［11］。因此，如何促進神經干細胞增殖，對于提高細胞移植治療脊髓損傷的療效是十分有必要的。過去，人們一直認為EPO只是一種作用于造血細胞的內分泌激素，但隨著人們對EPO研究的深入，EPO已被證實是一種新型的具有神經保護作用［5，12-13］的組織因子。其體外應用可以促進新生鼠脊髓來源NSCs或成年大鼠海馬來源 NSCs的增殖［6，14］，而關于 EPO 促進成年大鼠脊髓中央管膜下NSCs增殖的研究還較少。

圖2 NSCs的Nestin、Sox2染色鑒定Fig.2 Immunofluorescence stain of adult rat spinal cord

圖3 CCK8檢測細胞活力Fig.3 OD values of neural stem cells affected by EPO of different concentation were evaluated by CCK8 at different time points

圖4 細胞計數檢測NSCs增殖情況Fig.4 Cell counts at 96 h after treatment of different concentrations of EPO in NSCs

圖5 qPCR檢測Cyclin D1 mRNA表達Fig.5 The relative expression levels of Cyclin D1 mRNA of NSCs at 96 h after treatment with different concentrations of EPO were determined by qPCR

本研究通過可靠的提取方法從成年SD大鼠脊髓中央管膜下提取出神經干細胞，并通過Nestin和Sox2免疫熒光染色鑒定提取、培養的細胞正是神經干細胞。Nestin是神經前體細胞的標志性蛋白［15］，表明從脊髓中央管膜下所提取的細胞正是NSCs；Sox2是神經干細胞保持自我更新能力和維持多能干性的一種核內轉錄因子［16］，表明從脊髓中央管膜下所提取NSCs不但有自我更新能力，還具備一般NSCs所擁有的多能干性。此后，我們通過CCK8檢測發現20 U/mL EPO處理組在72 h（P＜0.05）和96 h（P＜0.001）兩個時間點與對照組比較差異有統計學意義，且時間長達96 h時有統計學差異。該結果說明20 U/mL濃度EPO可有效促進NSCs的增殖，且在96 h最為顯著。同時，96 h的細胞計數表明20 U/mL組的脊髓中央管膜下NSCs細胞數量較對照組有所增加（P＜0.01），也從細胞數量上直觀地反映出20 U/mL濃度EPO對NSCs的增殖效應。Cyclin D1是重要的細胞周期調控蛋白［17］，主要作用為促進細胞從G1期進入S期。熒光定量PCR結果示20 U/mL組脊髓中央管膜下NSCs的Cyclin D1 mRNA相對表達水平較對照組有明顯提高，結合CCK8檢測、細胞計數結果，表明20 U/mL濃度EPO可能通過上調Cyclin D1 mRNA表達，增加細胞周期調控蛋白Cyclin D1生成，從而促進更多NSCs細胞周期進入S期以發揮促細胞增殖效應。WANG等［6］通過細胞周期分析發現EPO可能通過促進新生鼠NSCs進入S期、增加DNA合成以促進細胞分裂增殖，該機制分析與筆者的推測一致。

綜上所述，本實驗首先成功從成年大鼠脊髓中央管膜下分離出NSCs，進而探討了不同濃度EPO對于成年大鼠脊髓中央管膜下NSCs增殖能力的影響，發現20 U/mL的濃度和96 h的處理時間可能是發揮EPO的促增殖作用的適宜濃度和處理時間。最后，也初步探討了EPO促進成年大鼠脊髓中央管膜下NSCs增殖的細胞周期影響機制。但EPO體外培養促進成年NSCs增殖和生存的具體分子機制及上下游信號通路仍有待深入探討，這也是本課題組未來將致力研究的方向。

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