重組分泌型腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體腺病毒對PC-3細胞荷瘤鼠瘤體的生長抑制

高磊 潘鐵軍 謝鳴 蔣淵 喻希 李想

中國人民解放軍武漢總醫院泌尿外科（武漢 430070）

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）被發現后，經過不斷研究證實其在細胞凋亡中發揮重要作用。TRAIL能誘導多種腫瘤細胞的凋亡，被認為是一種很有前途的抗癌分子。我們前期成功構建了表達分泌型TRAIL基因的腺病毒載體Ad-sTRAIL，并且在體外實驗中證實了Ad-sTRAIL可以抑制前列腺癌細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。本研究試圖探討Ad-sTRAIL的體內抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

1.1.1 人前列腺癌細胞株 PC-3購于中國科學院上海細胞庫。Ad-LacZ病毒，Ad-sTRAIL病毒均由本科構建保存。鼠抗人TRAIL單克隆抗體及兔抗鼠熒光素標記二抗均購自Santa公司。新生牛血清購于北京四季青生物技術公司；RPMI 1640細胞培養基（Gibco BRL公司）。DAPI染色液購于Beyotime公司。TUNEL檢測試劑盒購于Roche公司。本研究起止時間為2015年3月至2016年10月。

1.1.2 分組 Control組：常規培養的PC-3細胞；Ad-LacZ組：40 MOI的Ad-LacZ感染的PC-3細胞；Ad-sTRAIL組：40 MOI的Ad-sTRAIL感染的PC-3細胞。

1.2 方法

1.2.1 DAPI染色檢測細胞凋亡 高壓消毒后無菌蓋玻片置于24孔板中，取細胞濃度5×105/mL，每孔300 μL，接種后每24小時分別以40 MOI的Ad-LacZ和Ad-sTRAIL感染相應分組細胞，繼續常規培養48 h。以4%多聚甲醛固定爬片，經0.1%Triton PBS作用5 min，0.01 mol/L PBS溶液洗滌，滴加DAPI染液染色10 min，流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光封片液，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 Transwell實驗 采用孔徑為8 μm的24孔Borden小室（美國BD公司）進行實驗。先用無血清培養液沖洗小室上室2次，然后加入1∶8稀釋的Matrigel膠（美國BD公司）50 μL，37℃孵育30 min制作人工基底膜。以無血清培養基調整細胞密度為2 × 105個/mL，上室加入細胞懸液200 μL，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養液，37℃培養72 h后以Giemsa染色觀察穿入下室面的細胞數。

1.2.3 體內抗腫瘤實驗 PC-3細胞接種于雄性BALB/c裸鼠右側腋窩皮下（第四軍醫大學實驗動物中心提供）。待瘤塊長至足夠大時，取新鮮腫瘤組織在生理鹽水中剪成3 mm×3 mm×3 mm大小的小塊接種裸鼠右側背部，選取荷瘤成功的裸鼠18只；隨機分為3組，每組6只，分別為對照組、Ad-LacZ組和Ad-sTRAIL組。實驗開始后7、14 d給藥，共給藥2次。每3天測量1次瘤體的長徑（a）和短徑（b），按腫瘤體積V=a×b2/2。共觀察21 d，依據腫瘤體積計算腫瘤抑瘤率（%）=1-實驗組腫瘤體積/對照組腫瘤體積。

1.2.4 荷瘤組織免疫組化 4%多聚甲醛固定，制作蠟塊、切片、貼片；用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次3 min。PBS清洗；加入0.3%的過氧化氫甲醇溶液30 min，PBS清洗5 min×3；0.3%Triton×100處理30 min，PBS清洗5 min×3。加入1∶500稀釋的鼠抗人TRAIL單克隆抗體，4℃存放24 h；吸去抗體，PBS清洗5 min×3。加入PBS稀釋的以生物素標記的兔抗鼠二抗，室溫孵育2 h。PBS清洗5 min×3。加入ABC復合物，室溫孵育2 h，PBS清洗5 min×3；蒸餾水迅速沖3次。加入DAB顯色10 min，用蒸餾水迅速沖洗，蘇木素復染30 s；梯度酒精脫水之后，封片，拍照。

1.2.5 荷瘤組織TUNEL染色 4%多聚甲醛固定，制作蠟塊、切片、貼片；用二甲苯及梯度乙醇；PBS漂洗3次；用Proteinase K工作液處理組織15 min在37℃；PBS漂洗3次；加50 μL TUNEL反應混合液于標本上，加蓋玻片反應37℃×1 h。PBS漂洗3次；加50 μL converter-POD于標本上，加蓋玻片反應37℃×30 min。PBS漂洗3次；在組織處加100 μL DAB底物，反應25℃×10 min；PBS漂洗3次；拍照后再用蘇木素復染30 s。梯度酒精脫水之后，封片，拍照。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0進行統計學分析，結果中定量數據用±s表示，均數間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DAPI染色 Ad-sTRAIL組腫瘤細胞凋亡水平明顯高于Control組和Ad-LacZ組。Ad-sTRAIL組腫瘤細胞出現皺縮，胞漿致密，核染色質邊集，并且胞核裂解，形成含核碎片和細胞器成份的凋亡小體（圖1）。

2.2 TranswellAd-sTRAIL組穿入下室面的細胞數（24.8±3.70）明顯少于對照組（47.6±4.28，q=10.68，P＜0.01）及Ad-LacZ組（49.6±4.39，q=11.61，P＜0.01）。見圖2。

2.3 體內抗腫瘤實驗 與Control組和Ad-LacZ組的細胞相比，Ad-sTRAIL組的荷瘤鼠腫瘤生長能力顯著降低（圖3）。經計算后可見Ad-sTRAIL對荷瘤鼠腫瘤的抑制率3 d為8.15%（P＜0.05），6 d為11.55%（P＜0.01），9 d為17.23%（P＜0.01），12 d為20.05%（P＜0.01），15 d為27.18%（P＜0.01），18 d為34.27%（P＜0.01），21 d為33.08%（P＜0.01），隨時間抑制作用逐漸增強。

圖1 Ad-sTRAIL對PC-3細胞凋亡的影響（×200）Fig.1 The effects of Ad-sTRAIL on PC-3 cells apoptosis（× 200）

圖2 Ad-sTRAIL對PC-3細胞侵襲能力的影響（×200）Fig.2 The effects of Ad-sTRAIL on PC-3 cells invasion（× 200）

圖3 Ad-sTRAIL對荷瘤鼠腫瘤增殖能力的影響Fig.3 The effects of Ad-sTRAIL on the tumor proliferation of tumor-bearing mice

2.4 免疫組化實驗 Ad-sTRAIL組荷瘤鼠腫瘤組織中TRAIL表達水平明顯高于Control組和Ad-LacZ組（圖4）。TUNEL實驗顯示：Ad-sTRAIL組荷瘤鼠腫瘤細胞核染色明顯，表明該組細胞凋亡水平明顯高于Control組和Ad-LacZ組（圖5）。

3 討論

前列腺癌是男性生殖系統常見的惡性腫瘤。在北美和歐洲國家中，前列腺癌為男性的第二大惡性腫瘤，在我國的發病率也有明顯增加的趨勢［1］。目前，對于伴發轉移的難治性前列腺癌主要的治療方法是化療。但由于前列腺癌屬于對化療不敏感的腫瘤，并常產生耐藥性，所以常規化療很難達到令人滿意的治療效果。隨著對腫瘤發病機制的不斷研究，基因治療已成為前列腺癌治療的重要方法［2］。

TRAIL是腫瘤壞死因子家族的新成員，其可誘導腫瘤細胞發生凋亡等，但對正常的細胞卻無影響［3］。有研究表明：TRAIL可以抑制人肺癌細胞的增殖，促進腫瘤細胞凋亡；并且當TRAIL與格列吡嗪聯合應用時可以發揮更好的抗腫瘤效果［4］。同時，TRAIL在小細胞肺癌和肝癌中發揮重要作用，其主要是通過活化Caspase-8達到促進腫瘤細胞凋亡的效果。但TRAIL的促凋亡作用可被DNA損傷誘導凋亡抑制因子（DNA damage-induced apoptosis suppressor，DDIAS）減弱［5］。此外，TRAIL可與結腸癌細胞中的死亡受體結合，活化Fas相關的死亡結構域蛋白（Fas associated death domain protein，FADD），從而促進結腸癌細胞凋亡。并且，TRAIL與熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）聯合應用可以進一步增強其促凋亡作用［6］。大量研究表明TRAIL可以誘導多種腫瘤細胞凋亡［7］。作為腫瘤壞死因子家族TNF相關的凋亡誘導配體，TRAIL可與死亡受體（TRAIL-R1和TRAIL-R2）結合，激活Caspase信號通路，進而引起細胞凋亡。TRAIL-R2在前列腺癌中高表達，特別是晚期前列腺癌［8］。因此前列腺癌細胞對TRAIL反應敏感，所以構建表達TRAIL的腺病毒用于治療前列腺癌存在理論基礎［9］。本研究成功構建了表達分泌型TRAIL基因的腺病毒載體Ad-sTRAIL；并以該載體感染前列腺癌細胞株PC-3，結果表明經Ad-sTRAIL感染組腫瘤細胞凋亡水平明顯增加；同時Ad-sTRAIL還抑制了PC3細胞的侵襲能力。TRAIL蛋白表達水平增加導致其與死亡受體結合增加，誘導胞內死亡結構域變構，從而催化裂解Caspase-8前體，激活形成活化型Caspase-8，進一步放大凋亡信號以誘導細胞死亡。進一步的實驗也驗證了這一結論，DAPI染色顯示Ad-sTRAIL感染前列腺癌細胞后，腫瘤細胞凋亡水平顯著提升，出現皺縮，胞漿致密，核染色質邊集，并且胞核裂解，形成含核碎片和細胞器成份的凋亡小體。另外，Transwell試驗結果顯示Ad-sTRAIL感染后細胞侵襲轉移的能力明顯降低。進一步荷瘤鼠實驗表明，Ad-sTRAIL組的荷瘤鼠腫瘤生長能力顯著降低，證明Ad-sTRAIL在體內亦能發揮抑制腫瘤生長的作用。免疫組化實驗及TUNEL實驗證實，荷瘤鼠腫瘤組織中TRAIL表達水平的增加導致了腫瘤細胞凋亡水平的增加。

圖4 TRAIL蛋白在3組荷瘤鼠腫瘤組織中的表達（×200）Fig.4 The expression of TRAIL protein in tumors of three groups tumor-bearing mice（× 200）

圖5 Ad-sTRAIL對3組荷瘤鼠腫瘤細胞凋亡的影響（×200）Fig.5 The effects of Ad-sTRAIL on tumor cells apoptosis of three groups tumor-bearing mice（× 200）

綜上所述，通過提高TRAIL的表達在體內外均可以抑制PC-3細胞增殖，促進細胞凋亡；其具體機制可能是通過增加前列腺癌細胞中TRAIL的表達來活化Caspase-3和Caspase-8達到促進前列腺癌細胞凋亡的作用。本研究成功在體內實驗中驗證了Ad-sTRAIL抗腫瘤效果，為下一步的臨床抗腫瘤研究奠定了基礎。

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