巴氏生孢八疊球菌用作混凝土裂縫愈合劑的活性研究

陳 歆， 韓依璇， 張國榮， 馬 聰， 朱小駿

(1.蘇交科集團股份有限公司 在役長大橋梁安全與健康國家重點實驗室， 江蘇 南京 211112；2.中南大學 土木工程學院， 湖南 長沙 410075； 3.河海大學 土木與交通學院， 江蘇 南京 210098)

近年來，隨著微生物學、地球化學、無機材料學、土木工程等學科間的交叉研究不斷發展，微生物誘導碳酸鈣沉淀技術逐步應用于各相關領域[1-4].本世紀初，國內外學者陸續開展了將這一技術應用于混凝土裂縫修補的研究[5-8].本文所用微生物為巴氏生孢八疊球菌(Sporosarcina pasteurii，以下簡稱S. pasteurii，在舊生物分類系統里稱巴氏芽孢桿菌，Bacillus pasteurii).其能通過分泌脲酶催化尿素水解，水解產物中的碳酸根離子能與前體鈣源中的鈣離子結合產生碳酸鈣沉淀.

作為最早被應用于土木工程領域的微生物之一，國內外學者對影響S. pasteurii活性的因素開展了許多研究.Bang等[9]證實了較高的菌濃度為S. pasteurii修復效果的保證.Okwadha等[10]研究了常規環境下不同微生物濃度、鈣離子濃度、尿素濃度以及溫度與pH值對脲酶活性的影響，得到了最適碳酸鈣沉積參數.趙茜[11]基于巖土工程的環境條件，也對脲酶作過類似的研究.李沛豪等[12]還探究了前體鈣源對碳酸鈣晶相的影響.但脲酶活性并不完全等同于微生物活性，S. pasteurii在混凝土裂縫修補過程中的活性是其存活能力、脲酶分泌能力及脲酶活性的綜合體現.而且，微生物技術在混凝土領域應用的研究起步較晚，對其應用于實體混凝土工程時面臨的迥異于土壤的復雜環境還缺乏針對性研究，對微生物(非單純脲酶)的強堿耐受性、尿素濃度適應性與溫度適應性等方面的研究有所欠缺，難以對工程應用提供理論支持.

基于此，本文不再以細菌所分泌的脲酶作為研究對象，而是對完整的細菌-尿素-鈣源溶液體系進行研究，在自變量及其范圍的選擇上更貼近愈合劑在戶外混凝土結構上施作時可能面臨的復雜環境.本文探究了弱堿至強堿環境下S. pasteurii的尿素水解活性與碳酸鈣產率的差別，考察了S. pasteurii的尿素濃度適應性與溫度適應性，分析了愈合劑中外加鈣源不足時的影響，測試了愈合產物的化學成分與晶體結構，為S. pasteurii用作混凝土裂縫愈合劑的施工作業提供技術指導與數據支持.

1 材料與方法

1.1 菌液制備

巴氏生孢八疊球菌(S. pasteurii)，中國普通微生物菌種保藏管理中心編號CGMCC 1.3687，分離號DSM33，分離源為土壤.菌液配置方法參照文獻[11]，配置菌株生長所需的培養基(酵母提取物，20g/L；NH4Cl，10g/L；MnSO4·H2O，10mg/L；NiCl·6H2O，1.2mg/L)，用NaOH溶液調節pH值至8.5，培養得到高濃縮菌液，放入4℃冰箱中冷藏待用.

1.2 試驗方法

測定碳酸鈣產量時外加鈣源為醋酸鈣，溶液中醋酸鈣與尿素的摩爾比為1∶1，采用對溶液反復離心水洗后烘干稱量的方法：在20℃下，待菌液與尿素在塑料管中反應90h后，電導率不再明顯變化，將醋酸鈣加入混合液中，擰緊管蓋震蕩，使醋酸鈣和混合液充分反應，生成白色沉淀，靜置24h.將塑料管置于離心機中離心(4000r/min，10min)，棄去上層清液后加入蒸餾水再次離心，反復3次后將沉淀物置于烘箱(80℃)中，6h后取出稱量，并留作元素組成與晶體結構分析的樣品.

2 結果與分析

2.1 強堿耐受性

不同初始pH值下的菌液電導率和細菌活性(即電導率的變化速率)隨時間的變化關系如圖1，2所示.不同初始pH值下S. pasteurii-尿素-醋酸鈣溶液體系的碳酸鈣產量見圖3.

圖1 不同初始pH值下菌液電導率隨時間的變化Fig.1 Time-varying conductivity of bacteria solutions with different initial pH values

圖2 不同初始pH值下菌液電導率變化速率隨時間的變化Fig.2 Time-varying conductivity variation rate of bacteria solutions with different initial pH values

圖3 不同初始pH值下菌液的碳酸鈣產量Fig.3 Production of calcium carbonate of bacteria solutions with different initial pH values

從圖1，2可以看出，初始pH值為12.0的菌液電導率先略有下降，而后開始上升，其上升趨勢相較初始pH值為8.5，10.0和11.0的3組曲線滯后6h.說明初始pH值為12.0的強堿性環境會在一段時間內抑制S. pasteurii的活性，但不足以對其造成傷害，S. pasteurii 會自我調節并分泌脲酶.初始pH值為13.0的菌液電導率及其變化速率維持恒定，可見初始pH值為13.0的強堿性環境超出了S. pasteurii的強堿耐受極限，S. pasteurii遭到破壞.

圖2中，除初始pH值為13.0的曲線外，其他曲線都大體呈現先降低后略升高最后降低至趨于0的態勢.結合圖1可見，初始pH=8.5條件下菌液反應最先達到平衡，其次是初始pH值為10.0和11.0的菌液，最后是初始pH值為12.0的菌液.由此可知，初始pH=8.5時，S. pasteurii菌液的電導率變化速率最先到達平衡，并且隨著環境初始pH值的升高，菌液電導率變化速率到達平衡所需時間延長.

由圖3可見，初始pH=13.0的環境下S. pasteurii不能誘導碳酸鈣沉淀.初始pH值為10.0～12.0時對S. pasteurii誘導碳酸鈣沉淀最有利.

基于上述分析，S. pasteurii作為混凝土(其孔溶液pH值一般大于12.5)裂縫愈合劑時，其活性可能會受到抑制.考慮到修補初期愈合劑中溶劑較多，對混凝土孔溶液有一定稀釋作用，其工作環境應當在S. pasteurii可耐受范圍之內.后期愈合劑中的溶劑蒸發，其對孔溶液的稀釋作用減弱，pH值重新升高，可能對S. pasteurii的存活構成威脅.因此，可考慮在愈合劑中增加酸堿緩沖組分.

2.2 尿素濃度適應性

不同尿素濃度下(初始pH=8.5)菌液電導率變化速率測試結果如圖4所示.

圖4 不同尿素濃度下菌液電導率變化速率Fig.4 Conductivity variation rate of bacteria solutions with different urea concentrations

由圖4可見，菌液電導率變化速率總體上隨尿素濃度升高而升高.在尿素濃度達到0.6mol/L后，菌液電導率變化速率趨于穩定.整體曲線走向與趙茜[11]對脲酶所做的試驗結果大體一致，證明各尿素濃度下細菌活性差異為脲酶活性差異，尿素濃度對S. pasteurii的脲酶分泌本身影響不大.實際工程中，愈合劑注入裂縫后其濃度會在蒸發作用下進一步提升，所以考慮到經濟性，工程應用時愈合劑中的尿素濃度宜為0.6mol/L.

2.3 溫度適應性

在10～40℃水浴下(初始pH=8.5，尿素濃度為1.0mol/L)菌液電導率和菌液電導率變化速率測試結果見圖5，6.

圖5 不同溫度下菌液電導率隨時間變化Fig.5 Time-varying conductivity of bacteria solutions at different temperatures

圖6 不同溫度下菌液電導率變化速率隨時間變化Fig.6 Time-varying conductivity variation rate of bacteria solutions at different temperatures

由圖5,6可見，在10～40℃內，S. pasteurii活性隨溫度升高而升高.隨著時間增加，S. pasteurii活性有所衰減，由溫度差異帶來的活性差距也逐漸減小.中國普通微生物菌種保藏管理中心資料顯示S. pasteurii的最適培養溫度為30℃，而Moyo等[14]的研究結果顯示脲酶的最適溫度為45℃以上，因此即使溫度超過30℃(江蘇省夏季日均最高氣溫)，其活性依然隨溫度上升(見圖5，6)，故建議該種愈合劑于夏季高溫時段施工作業.

2.4 外加鈣源不足的影響

不同初始pH值下S. pasteurii-尿素-氫氧化鈣溶液的pH值隨時間變化如圖7所示.

圖7 不同初始pH值下溶液pH值隨時間的變化Fig.7 Time-varying pH value of solutions with different initial pH values

由圖7可見，初始pH值為8.5，10.0，11.0的溶液pH值隨時間延長都很快被調節為9.5.初始pH值為12.0的溶液經過一段時間后，pH值也被調節為9.5，而初始pH值為13.0的溶液pH值一直維持恒定.

因此，在利用S. pasteurii作為混凝土裂縫愈合劑時，外加的前體鈣源一定要充足，否則將會消耗混凝土孔溶液中的氫氧化鈣，加劇混凝土的碳化，對保護層內鋼筋的耐久性和C-S-H凝膠基體的穩定性帶來不良影響.此外，尿素水解生成的(NH4)2CO3具有酸堿緩沖作用，會降低原混凝土孔溶液的堿度，所以S. pasteurii更適用于混凝土表層開裂的修補.

2.5 元素組成與微觀形貌

采用掃描電鏡能譜儀(SEM-EDS)對沉淀物進行化學元素分析，其結果見圖8和表1.沉淀物微觀形貌觀測和晶體結構分析結果見圖9，10.從圖8與表1中可判斷沉淀物應全部為碳酸鈣，尿素水解產物與醋酸鈣反應完全，肯定了S. pasteurii的工作效率.圖9顯示S. pasteurii-尿素-醋酸鈣體系沉淀物微觀形貌呈多晶球形，經XRD分析(見圖10)，其主要成分為球霰石，不同于以氯化鈣作前體鈣源時所生成的方解石[12].此結果與李沛豪等[12]的試驗結果相符.

2.6 修復效果

采用S. pasteurii-尿素-醋酸鈣作為裂縫愈合劑(尿素濃度0.6mol/L,室溫20℃)，按文獻[13]的方法對混凝土裂縫進行修補.修補后用水沖洗試件表面，用刷子刷去非裂縫處沉積的碳酸鈣(愈合劑在施用過程中溢出所致)，烘干.修補前、修補中、修補后的裂縫對比見圖11.修補后，白色沉淀物(球霰石形式的碳酸鈣)完全封閉裂縫表面，能阻礙外部有害物質進入混凝土內部，初步驗證了S. pasteurii-尿素-醋酸鈣體系作為混凝土裂縫愈合劑的可行性.混凝土裂縫內部的填充率及開裂混凝土各項性能的補償效果尚需進一步試驗研究.

圖8 掃描電鏡能譜儀分析圖Fig.8 SEM-EDS analysis diagram

ElementMass fraction/%Atomic number percentage/%C15.3028.43O29.1240.62Ca55.5930.95

圖9 沉淀物SEM形貌Fig.9 SEM micro morphology of precipitation

圖10 沉淀物XRD晶相分析結果Fig.10 XRD crystal phase analysis of precipitation

圖11 某裂縫修補前中后對比Fig.11 Comparison of a crack before, during and after healing

3 結論

(1)pH值為11.0～12.0的溶液體系對巴氏生孢八疊球菌誘導碳酸鈣沉淀最有利.但由于體系pH值低于混凝土孔溶液pH值，因此在實際應用時混凝土內部的強堿環境逼近或可能超出該菌的強堿耐受極限.

(2)工程應用時，愈合劑中的尿素濃度宜為0.6mol/L.在10～40℃范圍內，溫度越高，巴氏生孢八疊球菌活性越大，建議該種愈合劑于夏季高溫時段作業.

(3)利用巴氏生孢八疊球菌作為混凝土裂縫愈合劑時，外加的前體鈣源要充足，否則會對結構耐久性帶來不良影響.由于尿素水解生成的碳酸銨具有酸堿緩沖作用，會降低原混凝土孔溶液的堿度，因此該種愈合劑更適合混凝土表層開裂的修補.

(4)S. pasteurii-尿素-醋酸鈣溶液體系中的沉淀物呈多晶球形，為球霰石形式的碳酸鈣.該溶液體系可用于混凝土裂縫修補.

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