甜葉菊三個UDP-糖基轉移酶基因生物信息學分析

孫宇蛟，陳 欣，李 悅，徐慧瑩，董 源，王 左，康雨琦

（東北農業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

甜葉菊是一種含糖量很高的作物，葉片中的甜菊醇糖苷（steviol glycosides，SGs）是一種天然的甜味劑，其甜度是蔗糖的300倍左右，但熱量只有蔗糖的1/3 000[1]，因此，甜葉菊深受糖尿病、肥胖癥等相關疾病患者的關注。近些年來，甜葉菊被大規模運用到食品、醫藥等相關領域。它作為一種新型的食材和藥材，在國內外均廣受關注。有研究表明，作為甜菊醇糖苷生物合成途徑中的關鍵酶，尿嘧啶二磷酸-糖基轉移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）通常以甜菊醇為前體，合成不同的甜菊醇糖苷，對甜葉菊甜度和品質的提高有關鍵作用。

UGT基因種類多樣，在許多經濟和模式作物中均有研究。Brazier等人通過T-DNA插入手段，獲得了擬南芥T3代UGT72B1基因敲除株，發現ugt72b1植株（At4g01070）對3，4-二氯苯胺（3，4-dichloroaniline，DCA）和2，4，5-三氯苯酚（2，4，5-trichlorophenol，TCP）的結合能力顯著下降，證明了UGT基因在植物體內的脫毒作用[2]；Jackon等人通過對擬南芥UGT84B1基因過表達植株的研究，發現其具生長激素缺陷的現象，推測該基因可能參與植物激素平衡[3]；Chong等人通過抑制糖基轉移酶TOGT基因在煙草中的表達，發現在其植株中出現組織壞死、抗性降低等表型。推測該基因可能與植物防御相關[4]。

在世界范圍內，多數學者對甜葉菊糖苷轉運代謝、合成及其功能進行了研究，但在基因及蛋白質層面對甜葉菊尿嘧啶二磷酸-糖基轉移酶的研究卻不多。本研究依托于生物信息學分析，以甜葉菊3個UGT基因為研究對象，對其蛋白質進行了理化性質分析、初級及高級結構的預測、多序列比對分析，并與康乃馨、陸地棉等其他物種的UGT基因一同構建了分子進化樹，以期為甜葉菊作物UGT蛋白質研究及分子輔助育種提供參考及依據。

1 材料與方法

1.1 數據來源

甜葉菊3個尿嘧啶二磷酸-糖基轉移酶基因UGT76G1（AY345974）、UGT85C2（AY345978）、UGT91D1（AY345980）及其他物種UDT基因均來源于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 UGT基因各級結構的分析

采用在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預測UGT蛋白序列的一級結構，通過ProtScale在線工具（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質的親疏水性，利用SOPMA在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預測UGT蛋白序列的二級結構，采用SWISS-MODEL軟件（http://www.swissmodel.expasy.org/）預測蛋白質的三級結構。

1.3 多序列比對及分子進化樹的構建

通過Clustal X2和DNAMAN進行多序列比對分析，采用MEGA 7.0軟件對所有蛋白質編碼序列進行分子進化樹的構建，采用鄰接法（Neighbor-jioning，NJ）建樹，其中，校正值（bootstrap）設置為1 000，其他均為默認值。

2 結果與分析

2.1 UGT基因一級結構分析

UGT76G1、UGT85C2、UGT91D1對應蛋白序列通過https://web.expasy.org/protparam/進行分子量、等電點、氨基酸數量、帶正負點的殘基總數、分子式、不穩定指數和脂肪酸指數預測，相關結果如表1所示。經分析，從表1中可以看出，等電點集中于6左右，氨基酸數量為520～550個不等，不穩定指數集中于45左右，脂肪族指數為100左右。

表1 UGT基因一級結構分析

2.2 UGT蛋白質的親疏水性預測

通過https://web.expasy.org/protparam/預測所有蛋白質親疏水性（GRAVY）。UGT76G1、UGT85C2、UGT91D1對應的GRAVY值分別為－0.089，－0.077，－0.104，這初步說明3個蛋白質呈一定的親水性；通過http://web.expasy.org/protscale/網站，采用 Hphob./Kyte&Doolittle算法進一步進行親疏水性預測，圖1進一步認證了其均為親水性蛋白質。

圖1 UGT蛋白質親疏水性預測

2.3 UGT蛋白二級結構預測

利用SOPMA在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預測UGT蛋白序列的二級結構。經過分析，從表2和圖2中可以看出，各UGT蛋白含有35%～45%左右的α-螺旋及無規卷曲，含有15%左右的鏈延伸結構，較少的β-轉角。其中，UCT85C2、UCT76G1這2個蛋白除了含有較相近的β-轉角外，其余相似度高。

表2 UGT蛋白序列二級結構

圖2 UGT蛋白二級結構預測

2.4 UGT蛋白質高級結構預測

通過SWISS-MODEL預測所得序列蛋白質高級結構，3條序列均通過同源建模獲得結構預測。從圖3中可以看出，3個UGT蛋白結構均有所差異，推測可能是基因在進化過程中內含子插入或丟失造成的。

2.5 多序列比對分析

將甜葉菊中3個UDT基因序列通過Clustal X2及DNAMAN進行多序列比對分析，序列的總體相似度為42.60%.從圖4中可以看出，完全一致的序列占較小部分，序列間總體相似度不高，由此推測其在進化過程中存在一定的差異。

2.6 分子進化樹的構建

將甜葉菊（Stevia rebaudian）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、康乃馨（Dianthus caryophyllus）、棉豆（Phaseolus lunatus）和煙草（Nicotiana tabacum L.）中已報道的UGT基因通過MEGA 7.0軟件進行分子進化樹的構建。從圖5中可以看出，各分支自展值均大于80，說明建樹信息可靠。除此之外，對于同一物種，甜葉菊中的3個UGT基因進化關系比較遠；對于不同物種來說，甜葉菊AY345974基因與康乃馨BAD52007基因具有一定的親緣關系。總體可以看出，不同物種與同一物種間UGT基因均存在一定的進化關系。

圖3 UGT蛋白質高級結構預測

圖4 甜葉菊3個UGT基因序列比對

圖5 分子進化樹的構建

3 討論

本研究通過生物信息學手段對甜葉菊3個UGT蛋白質進行了一級結構親疏水性分析，二級結構、高級結構的預測，多序列比對和系統進化樹的構建。在親疏水性方面，甜葉菊中UGT蛋白質均為可溶蛋白質，呈較強的親水性。

向麗等人用5’-RACE和 RT-PCR方法克隆了1條三七UDP-糖基轉移酶基因，該基因編碼495個氨基酸，蛋白分子量為55 kD，屬于不穩定蛋白。其二級結構中α-螺旋占36.16%，β-轉角占11.31%，無規卷曲占52.53%，這與本研究中甜葉菊3個UGT基因二級的預測較為相符[5]。除此之外，郭書巧等人在甜葉菊中分離出與本研究同源性很高的UGT76G2基因，研究發現其與玉米、康乃馨、水稻等5種均存在一定的進化關系，但進化地位相差較遠，與本研究的進化樹結果較為相符[6]。

UGT基因為多拷貝、多家族基因，家族中基因數目比較多，功能不盡相同。近年來，多種UGT基因被漸漸發掘，例如李微微等人在甜葉懸鉤子中克隆了18條UDP-糖基轉移酶基因，在大腸桿菌中進行了異源表達，并對克隆的基因進行了初步的序列分析，為進一步挖掘和驗證甜葉懸鉤子中UGT基因功能奠定了基礎[7]。隨著生命科學和微機科學的迅速發展，生物信息學作為一門獨立學科，在發掘新基因、研究生物大分子功能方面發揮著重要作用[8]。本研究依托生物信息學手段，在甜葉菊作物中鑒定3個UDP-糖基轉移酶基因，并對其進行蛋白質功能的初步研究，為甜葉菊UGT基因的發掘、提高作物經濟效益方面的研究提供了新的思路。

［1］Brandle，J.E.，P.G.Telmer.Steviol glycoside biosynthesis［J］.Phytochemistry，2007，38（42）：1855.

［2］Brazier-Hicks，M.，R.Edwards.Functional importance of the family 1 glucosyltransferase UGT72B1 in the metabolism of xenobiotics in Arabidopsis thaliana［J］.Plant Journal，2005，42（4）：556-566.

［3］RG Jackson，M Kowalczyk，Y Li，et al.Over-expression of an Arabidopsis gene encoding a glucosyltransferase of indole-3-acetic acid: phenotypic characterisation of transgenic lines［J］.Plant Journal，2002，32（4）：573-583.

［4］J Chong，R Baltz，C Schmitt，et al.Downregulation of a pathogen-responsive tobacco UDP-Glc：phenylpropanoid glucosyltransferase reduces scopoletin glucoside accumulation，enhances oxidative stress，and weakens virus resistance［J］.Plant Cell，2002，14（5）：1093-1107.

［5］向麗，郭溆，牛云云，等.三七PnUGT1基因的全長cDNA克隆和生物信息學分析［J］.藥學學報，2012，47（08）：1085-1091.

［6］郭書巧，楊郁文，倪萬潮.甜葉菊葡糖基轉移酶基因UGT76G2的克隆及生物信息學分析［J］.基因組學與應用生物學，2009，28（03）：422-428.

［7］李微微，孫雨偉，楊靖亞，等.甜葉懸鉤子（Rubus suavissimus S.Lee）中UDP-糖基轉移酶基因的克隆、表達及序列分析［J］.工業微生物，2017，47（04）：1-10.

［8］齊安智.計算機算法在生物信息學中的應用研究［J］.中國新通信，2018，20（02）：171.