兩種組合顯色系統(tǒng)用于分枝桿菌快速藥物敏感性試驗的性能研究

孫戰(zhàn)強

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)重大傳染病之一[1]。隨著耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病疫情的快速上升，簡單、快速和高效的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)技術(shù)成為迫切需求。基于耐藥突變基因的分子生物學(xué)方法因結(jié)核分枝桿菌耐藥機制的復(fù)雜性，仍不能完全滿足臨床需求[2]。而細菌學(xué)藥敏試驗和最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測定成為抗結(jié)核新藥篩選[3]和個體化精準治療的重要手段。近年來，基于氧化還原代謝原理并廣泛應(yīng)用于細胞培養(yǎng)、細菌增殖的方法，如阿爾瑪藍法、刃天青法、四唑鹽法等顯色方法，因簡單、快速、價廉等優(yōu)勢在結(jié)核分枝桿菌的快速藥敏試驗中得到廣泛應(yīng)用[4-7]。其中，四唑鹽法，尤其是新一代的水溶性四唑鹽3,3′-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉(XTT)因其背景值低、顯色快、試劑組合多變、價格低廉等特點使其更具有抗結(jié)核藥物高通量篩選和快速進行藥敏試驗的潛能。通常，XTT通過細胞跨膜電子傳遞系統(tǒng)發(fā)生帶顏色變化的還原反應(yīng)，但XTT帶有較高的負電荷難以接近或透過細胞膜，顯色速度緩慢，一旦加入合適的中間電子受體進行介導(dǎo)則可提高反應(yīng)速度[8-9]。前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)XTT/1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯(mPMS)組合顯色系統(tǒng)(簡稱“XTT/mPMS”)可用于抗結(jié)核藥物高通量篩選[10]。在此基礎(chǔ)上，筆者進一步深入檢測XTT/mPMS及其對照XTT/2-甲基-1,4-萘醌(mNQ)組合顯色系統(tǒng)(簡稱“XTT/mNQ”)用于分枝桿菌快速藥敏試驗的性能，并對XTT/mPMS用于結(jié)核分枝桿菌臨床分離株快速藥敏測定的性能進行評估。

材料和方法

1.材料：結(jié)核分枝桿菌 H37Ra(ATCC 27294)和牛分枝桿菌BCG(ATCC 35745)由河南省胸科醫(yī)院提供，恥垢分枝桿菌mc2155為本實驗室保存菌株。XTT、mPMS(1-methoxy-PMS)、mNQ(2-methyl-1,4-NQ)、刃天青、利福平(RFP)、異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(Sm)、左氧氟沙星(Lfx)等試劑購自美國Sigma公司；米氏7H9(Middlebrook 7H9)培養(yǎng)基和營養(yǎng)添加劑[油酸-白蛋白-右旋糖-過氧化氫酶(OADC)]購自美國BD公司；羅氏培養(yǎng)基購自上海成海公司；中國細菌濁度標準由中國藥品生物制品檢定所提供(批號為2009-1)。DH6000AB型恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器廠)、AM-9602A型酶標儀(美國AMIS Medical公司)。

2.菌液制備：參考文獻[10]，比濁法配制1麥式濃度(約1.5×108CFU/ml)的菌液。即：結(jié)核分枝桿菌H37Ra、牛分枝桿菌、恥垢分枝桿菌活化后，挑取單菌落轉(zhuǎn)移至含0.05% Tween-80的7H9-S(7H9+OADC)液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。待分枝桿菌生長到對數(shù)期后吸取菌液，用2～4 mm的玻璃珠漩渦振蕩2～5 min磨菌，比濁法調(diào)整菌液濃度至1麥式濃度。

3.試劑制備：XTT、刃天青溶于1×磷酸鹽緩沖液(PBS)，mPMS溶于雙蒸水，mNQ溶于二甲基亞砜，XTT、mPMS和mNQ分別配制成0.2～48.0 mmol/L、0.2～12.8 mmol/L和0.2～12.8 mmol/L濃度。所有試劑用0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存(XTT于-20 ℃保存)備用。使用時各取10 μl單獨加樣或直接混合后再加樣。

4.XTT微量顯色檢測：將培養(yǎng)好的菌株用7H9培養(yǎng)基稀釋并調(diào)節(jié)濃度。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入菌懸液180 μl，分別加入中間電子受體和XTT各10 μl，37 ℃培養(yǎng)2～4 h后采用450 nm酶標儀判讀。

5.XTT和中間電子受體(IEAs)濃度優(yōu)化：正交試驗設(shè)計，XTT濃度0.0～2.4 mmol/L，mPMS濃度0.00～0.64 mmol/L，mNQ濃度0.0～6.4 mmol/L，培養(yǎng)時間0～8 h，菌懸液濃度(0.0～3.0)×109CFU/ml，每個因子按5個水平分析。根據(jù)初步優(yōu)化結(jié)果，采用L25(25)矩陣法進一步優(yōu)化，將XTT濃度0.00～0.25 mmol/L和IEAs濃度0.00～0.08 mmol/L設(shè)置5個水平，進行上述的微量顯色檢測，最終獲得最佳組合濃度，試驗重復(fù)3次。

6.顯色系統(tǒng)穩(wěn)定性評估：根據(jù)上述最佳優(yōu)化濃度，配制含XTT、mPMS、mNQ、XTT/mPMS和XTT/mNQ的7H9培養(yǎng)基，在96孔板中每孔80 μl，37 ℃培養(yǎng)8 d。將100 μl活化好的恥垢分枝桿菌菌懸液(1.5×108CFU/ml)，于每天分別加到上述含顯色試劑96孔板的未加過菌懸液的新孔中，再共同培養(yǎng)90 min后于紫外分光光度計判讀450 nm 波長處吸光度值(A450值)，持續(xù)8 d。

分別準備適宜濃度的如下試劑溶液：XTT/mPMS、XTT/mNQ、XTT、mPMS、mNQ，每管40 μl分裝到數(shù)個500 μl EP管中，于4 ℃和25 ℃不同溫度條件儲存試劑。每隔5 d取出一管試劑，采用上述的XTT微量顯色法進行長時間穩(wěn)定性檢測。

7.藥物干擾實驗：96微孔板中用7H9液體培養(yǎng)基二倍稀釋法將常見抗結(jié)核藥物RFP、INH、EMB、Sm、Lfx等梯度稀釋成一系列的藥物濃度(500.00～15.62 μg/ml)。各試驗孔再加入20 μl的XTT/mPMS或者XTT/mNQ顯色試劑混合物。37 ℃恒溫培養(yǎng)15 d，每隔1 d在450 nm波長下檢測A450值。各試驗孔重復(fù)3次。

圖a顯示XTT/mPMS顯色系統(tǒng)，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統(tǒng)圖1 XTT/IEAs顯色系統(tǒng)優(yōu)化試驗

8.細胞毒性試驗：在96微孔板中，20 μl XTT/mPMS或XTT/mNQ顯色試劑混合物與180 μl恥垢分枝桿菌菌液(1.5×105CFU/ml)37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，未加顯色試劑的菌液作為陽性對照，每隔6 h取10 μl培養(yǎng)液采用文獻[11]方法進行菌落形成單位(CFU)計數(shù)。同樣的方法在牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌中共培養(yǎng)18 d，每隔2 d對CFU計數(shù)檢測1次，每次試驗重復(fù)3次。

9.XTT/mPMS顯色系統(tǒng)臨床評估：取藥敏試驗結(jié)果明確(固體培養(yǎng)法)的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株40株[敏感株(S)10株、單耐藥(DR)10株、耐多藥(MDR)10株、廣泛耐藥(XDR)10株]。對常見抗結(jié)核藥物的MIC檢測按照文獻[4]方法，略有修改。二倍稀釋法將抗結(jié)核藥物用每孔100 μl的 7H9-OADC 液體培養(yǎng)基于96微孔板中進行梯度稀釋至如下濃度：128.00～0.25 μg/ml(RFP)、32.00～0.06 μg/ml(INH)，生長對照孔不加藥物。每孔加入100 μl菌液(0.5麥式濁度，再1∶20稀釋)，37 ℃恒溫培養(yǎng)6～7 d，于第5天每孔加入20 μl的XTT/mPMS顯示試劑，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，顯色劑顏色由無色或淡黃色變化為深黃色或棕色，將阻止顏色變化孔所對應(yīng)的藥物濃度判為MIC值。如判讀不明顯的培養(yǎng)孔繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再判讀。刃天青MIC檢測方法同上，加入20 μl(濃度為0.1 g/L)顯示試劑后培養(yǎng)過夜，再如上述方法判讀(藍色變?yōu)樽霞t色)。藥敏折點值設(shè)置：RFP為0.5 μg/ml，INH為0.25 μg/ml。

10.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPASS 13.0軟件進行分析。計算檢測效能指標，相關(guān)計算公式：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。線性判斷采用Excel 2007軟件中的線性回歸分析。

圖a顯示XTT/mPMS顯色系統(tǒng)，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統(tǒng)圖2 不同菌株在XTT/IEAs顯色系統(tǒng)中顯色效果與與培養(yǎng)時間的線性關(guān)系

結(jié) 果

1.顯色劑的最優(yōu)配制比例：根據(jù)正交實驗分析，多因素與A450值的關(guān)系如圖1所示。發(fā)現(xiàn)在XTT與IEAs共培養(yǎng)中，mPMS的濃度達到0.04 mmol/L后，A450值達到一個平臺，而mNQ的濃度達到0.04 mmol/L 后A450值開始降低。 XTT濃度達到0.2 mmol/L后A450值達到2.0，濃度0.25 mmol/L時A450值達到最高。因此，確定兩個顯色系統(tǒng)的最優(yōu)濃度為0.2 mmol/L的XTT和0.04 mmol/L的中間電子受體。

圖a顯示XTT/mPMS顯色系統(tǒng)，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統(tǒng)圖3 XTT/IEAs顯色系統(tǒng)檢測限線性范圍試驗

2.顯色系統(tǒng)培養(yǎng)時間：對于恥垢分枝桿菌，XTT/mPMS顯色系統(tǒng)的顏色A450值在前90 min內(nèi)呈線性(圖2a)，XTT/mNQ顯色系統(tǒng)的顏色A450值于60 min就達到平臺期(圖2b)。對于結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌，兩種顯色系統(tǒng)的顏色A450值到420 min仍保持線性(R2值均大于0.9)，但XTT/mPMS系統(tǒng)的信噪比更高，其A450值接近0.5(圖2)。

3.細胞增殖和敏感度分析：XTT/mPMS 系統(tǒng)的顏色A450值與結(jié)核分枝桿菌在2.4×107～7.5×108CFU/ml濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系；對于恥垢分枝桿菌，僅在2.4×107～3.7×108CFU/ml呈線性關(guān)系(圖3a)。而XTT/mNQ系統(tǒng)具有更寬的線性檢測范圍(圖3b)。 此外，XTT/IEAs的顯色反應(yīng)強度存在種屬差異，即生長迅速的恥垢分枝桿菌顯色反應(yīng)強度明顯高于其他分枝桿菌(圖3)。

圖a、b顯示XTT/IEAs顯色系統(tǒng)在7H9液體培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性；圖a顯示XTT/mPMS顯色系統(tǒng)，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統(tǒng)。圖c、d顯示XTT/IEAs顯色系統(tǒng)在儲存條件下的穩(wěn)定性。圖c為顯色系統(tǒng)在4 ℃儲存1個月， 圖d為顯色系統(tǒng)在25 ℃儲存1個月圖4 XTT/IEAs顯色系統(tǒng)穩(wěn)定性試驗

4.顯色系統(tǒng)穩(wěn)定性分析：通過不同溫度儲存條件的試劑穩(wěn)定性實驗發(fā)現(xiàn)，XTT/mPMS與7H9培養(yǎng)基共孵育時，其穩(wěn)定性至少保持7 d(圖4a)，但同樣條件下XTT/mNQ僅能維持2 d(圖4b)。導(dǎo)致XTT/mNQ系統(tǒng)穩(wěn)定性下降的原因是mNQ穩(wěn)定性差(圖4b)。由于在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)XTT/IEAs熱穩(wěn)定性較低，40 ℃下失效嚴重，因此未能得到有效的加速破壞實驗數(shù)據(jù)，但得到了25 ℃常溫和4 ℃低溫儲存數(shù)據(jù)。XTT/mPMS在4 ℃儲存條件下，顯色性能至少能持續(xù)30 d(圖4c)，而XTT/mNQ系統(tǒng)4 ℃存儲5 d后，基本失效(圖4c)。與單組分儲存方式相比，顯色試劑混合物在存儲中會發(fā)生少量的非細胞還原反應(yīng)。在25 ℃存儲條件下，XTT/mPMS存儲10 d后其顯色效能開始明顯下降，其原因是XTT開始失效(圖4d)。而在XTT/mNQ顯色系統(tǒng)中，由于mNQ穩(wěn)定性差，存儲到5 d后，其顯色性能已明顯降低到無法使用(圖4d)。

5.顯色系統(tǒng)的細胞毒性試驗：細胞毒性實驗中XTT/mPMS與生長迅速的恥垢分枝桿菌共培養(yǎng)時，可使其到達生長穩(wěn)定期的時間延后12 h(圖5a)，但最終到達穩(wěn)定期的菌落數(shù)與對照組接近。在生長緩慢的牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌中，XTT/mPMS使分枝桿菌到達生長穩(wěn)定期的時間延后1～2 d，但最終達到穩(wěn)定期的菌液濃度與對照組接近(圖5b，c)。因此XTT/mPMS對分枝桿菌的生長具有較低的細胞毒性。而XTT/mNQ系統(tǒng)與恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌共培養(yǎng)時，試驗組比對照組均出現(xiàn)明顯的生長延遲，達到穩(wěn)定期后，菌液濃度也相對較低(圖5)。在3種分枝桿菌中，XTT/mPMS和XTT/mNQ均具有一定的細胞毒性作用，但XTT/mPMS的細胞毒性更低。

圖a為恥垢分枝桿菌，圖b為牛分枝桿菌，圖c為結(jié)核分枝桿菌圖5 XTT/IEAs 顯色系統(tǒng)細胞毒性分析

圖a顯示RFP干擾，圖b顯示INH干擾，圖c顯示Sm干擾，圖d顯示EMB干擾，圖e顯示Lfx干擾圖6 抗結(jié)核藥物對XTT/mPMS顯色系統(tǒng)的干擾檢測

6.XTT/IEAs受抗結(jié)核藥物干擾檢測：顯色系統(tǒng)在臨床使用中需要和抗結(jié)核藥物共培養(yǎng)，抗結(jié)核藥物自身所帶顏色可能會干擾顯色系統(tǒng)的正常判讀；此外，一些抗結(jié)核藥物可能會與顯色系統(tǒng)發(fā)生非細胞還原反應(yīng)。XTT/mPMS系統(tǒng)中，RFP的淡黃色可干擾XTT/mPMS的顯色讀數(shù)，這種干擾具有濃度依賴性，RFP濃度達到62.5 μg/ml以后，本底值已接近1.0，干擾嚴重(圖6a)。在INH中，高濃度的INH與顯色系統(tǒng)在共培養(yǎng)7 d以后，吸光度值接近1.0，干擾也比較嚴重(圖6b)。而Sm、EMB、Lfx等抗結(jié)核藥物均不與XTT/mPMS顯色系統(tǒng)發(fā)生非細胞還原反應(yīng)(圖6)。

7. XTT/IEAs臨床藥敏試驗檢測：選擇藥敏試驗結(jié)果已知(固體培養(yǎng)法)的40株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，同時采用XTT/mPMS和刃天青顯色系統(tǒng)進行RFP和INH的MIC檢測，結(jié)果如表1、2。 XTT/mPMS的藥敏試驗結(jié)果與刃天青一致。在對RFP和INH兩種藥物的檢測中，XTT/mPMS顯色法的敏感度和特異度都達到90%以上。陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值也都比較高。在臨床試驗中，XTT/mPMS組多在5～6 d獲得藥敏試驗結(jié)果，刃天青組多在6～7 d獲得藥敏試驗結(jié)果。

討 論

四唑鹽廣泛用于動物和微生物的藥敏試驗、活性、增殖等檢測，以及藥物篩選。在這些應(yīng)用中，目前最常用的水溶性四唑鹽是XTT，該化合物可產(chǎn)生水溶性甲臢便于后續(xù)操作和觀察[6, 12]。一般而言，XTT顯色系統(tǒng)需搭配IEAs以提高反應(yīng)速度，作為該顯色反應(yīng)系統(tǒng)核心成分的IEAs，常見的有苯醌、萘醌、蒽醌和吩嗪硫酸甲酯類化合物[8]。前期工作中，筆者通過大量的篩選和測試，發(fā)現(xiàn)XTT/mNQ可以用于抗結(jié)核藥物高通量篩選[10]。因此，筆者預(yù)測該顯色系統(tǒng)在分枝桿菌快速藥敏試驗中具有較強的優(yōu)勢。

傳統(tǒng)的XTT/mNQ顯色系統(tǒng)因其穩(wěn)定性差，給臨床大規(guī)模使用造成諸多障礙。首先，XTT/mNQ只能用于分枝桿菌液體培養(yǎng)后的終點加樣檢測。其次，終點加樣步驟增加了實驗操作人員的生物安全風(fēng)險。再次，XTT/mNQ顯色系統(tǒng)失效很快，只能是即用型試劑，既難以用于檢測試劑盒開發(fā)，也給臨床實際使用帶來巨大浪費。筆者發(fā)現(xiàn)，造成XTT/mNQ顯色系統(tǒng)失效的主要原因是mNQ的穩(wěn)定性較差。而XTT/mPMS系統(tǒng)在7H9液體培養(yǎng)基37 ℃ 共培養(yǎng)條件下至少8 d內(nèi)仍然穩(wěn)定，表明其具有與分枝桿菌共培養(yǎng)的潛能。即便在25 ℃儲存條件，XTT/mPMS仍具有至少保持15 d的穩(wěn)定性，表明其具有開發(fā)成藥敏試驗試劑盒的潛能。然而遺憾的是，筆者前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)XTT/mPMS會與7H9液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)添加劑OADC發(fā)生緩慢的顯色反應(yīng)[10]，使其在使用7H9+OADC培養(yǎng)基的分枝桿菌長期共培養(yǎng)快速藥敏試驗中受限。但這提示，在臨床上XTT/mPMS可用于快速生長型非結(jié)核分枝桿菌的共培養(yǎng)藥敏試驗，以及不包含OADC成分的其他液體培養(yǎng)基的長期共培養(yǎng)藥敏試驗。

表1 XTT/mPMS顯色系統(tǒng)以固體培養(yǎng)法為金標準的耐藥檢測效能

表2 刃天青顯色系統(tǒng)以固體培養(yǎng)法為金標準的耐藥檢測效能

此外，盡管筆者發(fā)現(xiàn)高濃度RFP的淡黃色，以及高濃度的INH與XTT/mPMS長時間共培養(yǎng)時可與其發(fā)生緩慢的顯色反應(yīng)后的淡黃色，給XTT/mPMS顯色判讀帶來干擾，但實驗中的藥物測試濃度遠高于臨床藥敏試驗的實際使用濃度，因此這一潛在的缺點并不影響臨床上的實際使用。

本研究中，XTT的顯色反應(yīng)原理是基于細菌的氧化還原反應(yīng)，這會依耐于菌株本身的活力。XTT顏色變化時間也高度依賴菌懸液濃度，濃度越高顯色越快。一個有趣的現(xiàn)象是，在同樣菌液濃度(麥氏1號)下，XTT在恥垢分枝桿菌培養(yǎng)液中顏色A450值達到平臺期需要60～90 min，而結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中至少需要420 min。這些現(xiàn)象共同表明，分枝桿菌的菌液濃度、種屬、細菌活力等因素會影響顯色反應(yīng)的速度和顯色強度。因為XTT顯色強度具有試劑濃度依耐性，這提示在臨床實際使用中可通過適當(dāng)提高XTT和mPMS試劑的濃度和延長判讀時間來彌補以上缺陷。

在臨床評估中，筆者發(fā)現(xiàn)XTT/mPMS顯色系統(tǒng)和刃天青法的藥敏試驗結(jié)果幾乎相同。相對于刃天青顯色法需要過夜再培養(yǎng)的情況，XTT/mPMS顯色系統(tǒng)在加入試劑后2 h即可判讀結(jié)果，更具有明顯的優(yōu)勢。筆者亦發(fā)現(xiàn)在MIC肉眼判讀時，對于那些顏色反應(yīng)臨界點難以判讀的狀態(tài)，XTT/mPMS的淡黃色比刃天青的藍色、紫色混合顏色更容易判讀(數(shù)據(jù)未展示)。此外，在臨床測試的終點加樣中，出現(xiàn)了1例污染，刃天青法因需過夜培養(yǎng)，最終未能準確判讀污染樣本的MIC值, 而XTT/mPMS終點加樣后只需2 h后即可判讀結(jié)果，規(guī)避了終點加樣操作引入污染的現(xiàn)象。

綜上，筆者對XTT/mPMS在分枝桿菌快速藥敏試驗的配方優(yōu)化和性能進行了系統(tǒng)性評估，首次闡明了XTT/mPMS顯色系統(tǒng)在分枝桿菌液體培養(yǎng)中的穩(wěn)定性、細胞毒性、藥物干擾反應(yīng)特性，以及初步的臨床藥敏檢測效能。結(jié)果表明，XTT/mPMS顯色系統(tǒng)可以用于分枝桿菌快速藥敏或MIC檢測。本研究為臨床上使用簡單、廉價、高效的分枝桿菌MIC快速檢測、適用于分枝桿菌MIC快速檢測共培養(yǎng)試劑的研發(fā)，以及基于細菌學(xué)的抗分枝桿菌藥物高通量篩選技術(shù)的運用提供重要參考。

志謝感謝張朝寶同學(xué)在研究生階段參與了預(yù)試驗和文獻檢索工作，感謝趙俊偉同學(xué)和玄松花同學(xué)給予了工作上的協(xié)助。感謝武漢醫(yī)療救治中心檢驗科馬峻醫(yī)生及其相關(guān)同事對臨床實驗的支持和幫助。

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