玫瑰轉錄因子RrMYB10的克隆及表達分析

鄒 凱，李忠健，李政宏，趙蘭勇，徐宗大

（山東農業大學林學院，山東 泰安 271018）

花青素（Anthocyanins）是植物組織呈色的重要非光合色素，決定花、果實、種子的顏色[1-2]。在高等植物中，花青素的合成由苯丙烷途徑中類黃酮合成途徑完成[3]，研究表明植物通過合成酶和蛋白來調控花青苷的合成，而MYB、WD40和bHLH三類轉錄因子是這些酶和蛋白合成過程中的主要轉錄因子，三者組成三元復合體來調控花青苷的合成和積累[4-5]。其中，R2R3-MYB轉錄因子在植物花青苷合成的中起著重要的作用，前人研究結果表明，在月季[6]、金魚草[7]、擬南芥[8]以及葡萄[9]中，R2R3-MYB 轉錄因子對花青苷的合成起著至關重要的作用。

玫瑰（Rusa rugosa）為薔薇科薔薇屬的一種落葉灌木，觀賞價值高，芳香四溢，在園林造景中具有重要作用[10]。玫瑰花色單一是制約玫瑰應用的主要問題，玫瑰花色主要為玫紅色、粉色、白色，鮮見其他花色。所以，克隆玫瑰花瓣中有關調控花青苷的基因，對闡明玫瑰花瓣中花色苷的調控機理，進而改變玫瑰的花色具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2016年4月至2017年1月在山東農業大學南校花卉實驗基地及花卉研究室進行。

1.2 試驗材料

試驗材料為玫瑰品種 ‘紫枝’（Rosa rugosa‘Zizhi’）、‘白紫枝’（Rosa rugosa‘Baizizhi’）以及‘粉紫枝’（Rosa rugosa‘Fenzizhi’），于 2016 年 4 月-5月份選取生長勢強，花色穩定單株，采集花瓣經液氮處理后，于-80℃冰箱中保存備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因克隆

玫瑰花瓣參照改良CTAB法[11]以及EASYspin植物RNA快速提取試劑盒的說明書提取其總RNA于用-80℃冰箱中保存備用，運用紫外分光光度法檢測所提取RNA的純度和濃度。將濃度及參數符合要求的RNA參照abm反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA第一鏈。根據玫瑰花瓣轉錄組數據，查找得到目的基因的RrMYB10的部分cDNA序列，根據所得序列設計特異性引物[20]：

RrMYB10 F：5’ -ATGGAGGGTTTCGGCGTGAGA-3’

RrMYB10 R：5’ -CAACCCAGAAGTTTGTAAAGAAGTCG-3’

以上一步合成的cDNA為模板，用設計的特異性引物PCR擴增目的基因。PCR反應體系為：滅菌ddH2O 9.5ul、2×EasyTaqSuperMix 12.5?l、 目的基因上下游引物各 1?l、模板cDNA 1ul，總計25ul。PCR反應條件為：94℃預變性 5min；94℃變性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環，72℃保溫 10min。將PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下參照Magen膠回收試劑盒說明書回收目的條帶，將目的條帶連接到PMD18-T載體上，轉化大腸桿菌后送華大測序。

3’RACE擴增，根據測序得到目的基因的cDNA序列，設計巢式PCR基因特異性引物[20]，進行巣式PCR擴增：

RrMYB10-1：5’-ATGGAGGGTTTCGGCGTGAGA-3’

RrMYB10-2：5’-ACTTCTTTACAAACTTCTGGG-3’；

B26：5’ -GACTCTAGACGACATCGATTTTTTT TTTTTTTTTT-3’。

將濃度及參數符合要求的RNA參照abm反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA第一鏈。以上一步合成的cDNA為模板，用設計的特異性引物進行巣式PCR擴增。第一輪PCR：引物RrMYB10-1與B26做第一輪PCR的引物，PCR反應體系同上，反應條件為 94℃預變性 5min；94℃變性 30s，58℃退火30s，72℃延伸 1min，35 個循環，72℃保溫 10min。第二輪PCR：引物RrMYB10-2與B26作為第二輪PCR引物，第一輪PCR產物稀釋100、500、700倍作模板，反應體系同上，反應條件為94℃預變性5min；94℃變性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環，72℃保溫10min。將PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照Magen膠回收試劑盒說明書回收目的條帶，將目的條帶連接PMD18-T載體上，轉化大腸桿菌后送華大測序。

1.3.2 生物信息學分析

利用NCBI中的Blast比對軟件對目的基因的氨基酸序列進行同源性分析，利用DNAMAN軟件對目的基因和其他物種的氨基酸序列進行多重比對分析；利用ExPasy服務器中在線軟件ProtParam對目的基因進行理化性質預測；通過NCBI中在線軟件CD-Search對目的基因的保守域進行預測；利用在線軟件SOPMA對目的基因編碼的蛋白進行二級結構預測；利用在線軟件NetPhos 3.1Serve和NetOGLyc 4.0 Server對目的基因編碼的蛋白進行磷酸化位點、糖基化位點和信號肽進行預測；利用在線軟件TMpred對目的基因編碼蛋白進行跨膜結構域的預測；利用MEGA5.0構建RrMYB10的系統樹。

1.3.3 構建表達載體

根據RrMYB10的測序結果，除去終止子，設計分別含有NcoI和BstEII酶切位點的引物[20]。

RrMYB10 NF：5’-CCCATGGCCATGGAGGGTTT CGGCGTGAGA-3’

RrMYB10 BR：5’-CACGTGGTCAACGACTAGA TCATGGC-3’

以反轉錄得到的cDNA為模板，PCR擴增得到帶有酶切位點的目的條帶，其擴增產物通過NcoI和BstEII雙酶切后，利用SolutionI將同樣雙酶切的pc1304載體與雙酶切后的擴增產物在16℃條件下連接4h，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，篩選陽性克隆，送華大進行測序驗證得到構建好的表達載體pc1304-RrMYB10。

2 結果與分析

2.1RrMYB10的克隆

以玫瑰花瓣cDNA為模板，擴增得到643bp的cDNA序列，通過3’RACE擴增后得到251bp的一段cDNA序列，兩者經過拼接后得到871bp的cDNA序列全長 （圖2），利用DNAMAN對RrMYB10的堿基序列進行分析，發現其包括完整的開放閱讀框 （ORF），含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，開放閱讀框長度699bp，編碼232個氨基酸，含有polyA尾巴（圖1）。經過NCBI中blastx比對顯示，該基因與其他物種中MYB10的基因序同源性蛋白。構成RrMYB10蛋白的232個氨基酸中，一共包括20中氨基酸，其中亮氨酸（Leu）所占比例最大為 9.4%；其次是賴氨酸（Lys）和甘氨酸（Gly），所占高，故將基因命名為RrMYB10。

圖1 RrMYB10基因的cDNA序列及氨基酸序列Fig.1 RrMYB10 cDNA nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence

圖2RrMYB10基因的擴增Fig.2 PCR amplification of RrMYB10

2.2 RrMYB10生物信息學分析

2.2.1 蛋白基本理化性質分析

RrMYB10編碼232個氨基酸，利用在線軟件ProtParam分析表明，RrMYB10蛋白的分子式為C1230H1904N348O356S6，相對分子質量為27455.13Da，原子總數為3844個，等電點pI=9.01，該蛋白不穩定系數為42.31（＞40）,所提推測出該蛋白為堿性不穩定比例都是8.2%；所占比例最小的氨基酸是半胱氨酸（Cys）和蛋氨酸（Met），所占比例均為 1.3%。利用在線軟件ProtScale預測RrMYB10蛋白的疏水性，疏水性最大值為1.400，最小值為-3.189，平均疏水指數為-0.762，說明該蛋白偏親水蛋白。利用NCBI中在線軟件CD-Search對RrMYB10蛋白進行分析表明該蛋白含有Myb的保守域，序列在5’端22-165位具有pfam00249結構域，屬于MYB的保守結構域（圖 3）。

圖3 RrMYB10基因編碼蛋白保守結構預測Fig.3 Prcdicts conservative structure domain of RrMYB10

經在線軟件SOPMA分析，發現RrMYB10蛋白的二級結構以α-螺旋（Alpha helix）和無規則卷曲（Random coil）為主，其數量和所占比例分別為95個（40.77%）和 76個（32.62%）；其次是延伸鏈（Extended strand）和 β-轉角（Beta turn），其數量和所占比例分別為 41個（17.60%）和 21個（9.01%）（圖 4）。

經在線軟件NetPhos 3.1 Server分析，發現4.0Server分析，發現RrMYB10蛋白無糖基化位點，N端沒有發現信號肽。經在線軟件TMHMM分析RrMYB10蛋白的跨膜結構與，發現RrMYB10蛋白無跨膜結構域。

2.2.2 蛋白序列同源性及系統發育分析

圖4 RrMYB10基因蛋白二級結構預測Fig.4 Predication of secondary structure of RrMYB10

圖5RrMYB10與其它物種MYB蛋白序列對Fig.5 Multiple alignment of theRrMYB10 with other MYB

根據NCBI中blast比對結果，選擇同源性較高的野草莓（Fragaria vesca）78% 、梅（Prunus mume）62%、甜櫻桃（Prunus avium）62%以及桃樹（Prunus RrMYB10基因編碼的蛋白中，含有15個Ser磷酸化位點，15個Thr磷酸化位點，8個Tyr磷酸化位點，這些磷酸位點的存在說明該蛋白在可逆磷酸化調控中具有一定的作用。經在線軟件NetOGLyc persica）62%進行多重序列比對，比對結果如圖，結果表明RrMYB10蛋白具有MYB保守結構域（圖5）。

圖6 RrMYB10與其它物種MYB蛋白系統進化樹分析Fig.6 The phylogenetic tree derived from the alignment of amino acid secquences of RrMYB10 and other MYB

為了進一步探究RrMYB10蛋白與其他植物中MYB蛋白的親緣關系，從Blast比對的結果中選取了野草莓、梅、甜櫻桃在內的13個物種的氨基酸序列，利用MEGA5構建系統進化樹[12]。結果表明玫瑰先與同科的草莓、野草莓最先聚合，說明在進化上玫瑰與草莓親緣關系最近，接著與同科的蘋果、沙梨聚合為一個亞類，再與其他科物種聚合，說明，同科的植物之間親緣關系近，與不同科的其他植物親緣關系遠（圖6）。

2.3 RrMYB10載體構建

為了明確RrMYB10蛋白的功能，將構建好的載體pc1304-RrMYB10利用液氮速凍法轉化到農桿菌GV3101中，將轉化的農桿菌配制成侵染液侵染擬南芥，計劃后續進行轉基因功能驗證。

3 結論與討論

MYB家族是植物生命體中最為重要的轉錄因子家族之一，參與調控植物生長發育、生理代謝的各個方面[13]。R2R3-MYB主要參與植物次生代謝、細胞分化以及各種脅迫的調控[14]。本研究通過RTPCR以及RACE技術從玫瑰花瓣中分離得到了一個R2R3-MYB基因，該基因包含完整的開放閱讀框699bp，編碼232個氨基酸，其蛋白分子式為C1230H1904N348O356S6，相對分子質量為27455.13Da，等電點 pI為 9.01，該蛋白不穩定系數為 42.31（＞40）,為不穩定蛋白。

花青素屬于類黃酮類物質，也是植物組織著色的重要代謝產物[15]。Vimolmangkang等[16]發現超量表達蘋果R2R3型Md MYB3促進煙草的花青素苷和黃酮醇的合成，使轉基因煙草的花色變深。趙佳[6]等發現R2R3型 RhMYBs4-1和 RhMYBs6-1蛋白均可能促進花青苷的合成，本文研究所得到RrMYB10蛋白聚類分析發現與已報到的野草莓（ABX79948.1）、梅花（XP_008244325.1）以及甜櫻桃（AJB28496.1）等聚為一類，而這些MYB均有典型的R2R3結構，說明RrMYB10也具有典型的R2R3結構。

近幾年的研究過程中，植物中花青素的合成與其相關調控的轉錄因子的研究有了一定進展。Khar[17]等發現不同植物體內花青素的合成受到不同調控位點以及轉錄因子的控制；謝吉容等[18]發現R3型的MYB蛋白基因RhMYB1在粉紅色花瓣中的表達比黃色花瓣高，李軍[19]等發現在桑樹花青素的合成調控過程中，不同的MYB蛋白是有正負調控之分的。故本研究所克隆的RrMYB10只能確定其與花青素的調控有關，其具體作用還需要進行轉基因功能驗證。

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