抗DNA多克隆抗體免疫膠體金針對接觸性DNA孵育條件的建立

吳婷 朱洪建

【摘 要】文章利用免疫膠體金的生物化學特性，吸附反應體系中的DNA，通過離心將其分離，并經過洗滌再離心，沉淀可直接用于PCR反應。實驗結果表明：5μL和10μL免疫膠體金在室溫下振蕩孵育15 min對接觸性DNA有足夠的吸附能力。

【關鍵詞】抗-DNA多克隆抗體;膠體金;接觸性DNA

【中圖分類號】D919.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-0688（2018）12-0041-02

當前公安實戰中，現勘人員提取到的接觸類檢材越來越多，而接觸類檢材樣本中DNA含量很少，甚至存在大量PCR抑制劑，使得這類檢材檢出成功率很低。因此，我們需要探索一種能有效提高接觸類檢材檢測成功率與準確性的方法。

膠體金是氯金酸（chLoroaurie acid，）在還原劑如抗壞血酸、白磷、鞣酸和枸櫞酸鈉等作用下，由于靜電作用而成為一種穩定的膠體狀態，聚合成帶負電的疏水膠溶液。金顆粒為核，表面吸附和雙層離子，能與蛋白質分子以及其他非共價生物大分子如酶、抗生素、多肽、激素、毒素等正電荷基團形成靜電結合，且不影響其生物特性[1]。膠體金具有膠體的多種特性，特別是對電解質的敏感性，膠體金標記技術實質上就是蛋白質分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，吸附機理是利用膠體金顆粒表面帶負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合[2]。在膠體金的制備過程中，所使用的玻璃容器需要絕對清潔，否則污染物會干擾膠體金的生成，產生凝集顆粒，還原劑的用量和強弱可以決定膠體金的大小，一般為5～150 nm，還原劑量越大，所制備的膠體金顆粒越小[3]。

本研究選用的是將抗-DNA多克隆抗體標記到直徑為35 nm的膠體金顆粒上，制備而成免疫膠體金（immune coLLoidaL-goLd）。利用免疫膠體金的生物化學特性，吸附反應體系中的DNA，通過離心將其分離，并經過洗滌再離心，沉淀可直接用于PCR反應。

1 材料與方法

1.1 試劑及其來源

10 ng/uL DNA標準品：本實驗室。抗-DNA多克隆抗體免疫膠體金凍干粉劑：北京博奧森生物技術有限公司。滅菌純水：屈臣氏。PCR反應試劑：PowerPLex21試劑盒，Promega公司。電泳試劑：Hi-DiTM甲酰胺（AB公司）;PPLex21 ALLeLic Ladder（Promega公司）;CC5 ILS500（Promega公司）。

1.2 主要儀器

恒溫混勻儀Thermomixer comfort：德國Eppendorf。5424小型臺式離心機：德國Eppendorf公司。3130xL型遺傳分析儀：美國AB公司。9700型PCR擴增儀：美國AB公司。

1.3 針對接觸性DNA孵育條件的建立

（1）抗-DNA多克隆抗體免疫膠體金溶液的配置：取免疫膠體金凍干粉劑，加滅菌純水溶解，配置成濃度為0.4 mg/mL的免疫膠體金溶液備用。

（2）模擬接觸性DNA溶液的制備：提取DNA的標準品2 800 M（10 ng/μL）加入滅菌純水制成終濃度為0.025 ng/μL DNA溶液備用。

（3）分組：將濃度為0.025 ng/μL DNA溶液按DNA的量分為A、B 2組，每組11個樣本，進行3組平行試驗，記錄并編號。1號：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液10μL，DNA的量為0.25 ng;2號：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液20μL，DNA的量為0.5 ng;3號：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液40μL，DNA的量為1.0 ng;4號：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液60μL，DNA的量為1.5 ng;5號：取濃度0.025ng/μL DNA溶液80μL，DNA的量為2.0 ng;6號：取濃度0.025ng/μL DNA溶液100μL，DNA的量為2.5 ng;7號：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液120μL，DNA的量為3.0 ng;8號：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液140μL，DNA的量為3.5 ng;9號：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液160μL，DNA的量為4.0 ng;10號：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液180μL，DNA的量為4.5 ng;11號：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液200μL，DNA的量為5.0 ng;

（4）分別往A組的各個樣本里加入免疫膠體金5μL，分別往B組的各個樣本里加入免疫膠體金10μL，振蕩孵育15 min，13 000 r離心10min使免疫膠體金顆粒沉淀，吸取各樣本離心后上清液，轉移至另一0.5 mL管備檢，留沉淀并取2.5μL沉淀，直接用于PCR反應。剩余沉淀存放于4 ℃冰箱用于復檢。這樣分組實驗，保證了每種濃度留沉淀的樣本在同一種實驗方法下至少可以被獨立驗證6次，每種留上清液的樣本在同一種實驗方法下可以被獨立驗證3次，便于后續檢測結果的統計與分析。

（5）PCR擴增及擴增產物檢驗：使用GeneAmp PCR System 9700型擴增儀（AB公司）和PowerPLex21試劑盒（Promega公司），PCR反應液（4×模板）;引物混合物（2×Primer，2×Mix）;去離子水（2×water）。進行30次循環。擴增程序為：96 ℃，1min，循環0次;94 ℃，10 s，59 ℃，1 min，72 ℃，30 s，30次循環;60 ℃，10 min，4 ℃，forever。其余操作過程按照試劑和儀器說明書進行。取PCR擴增產物2μL加入8μL甲酰胺和2μL ILS500（Promega公司）經熱變性后，使用3130XL Genetic AnaLyzer（ABI公司）進行毛細管電泳，用Genemapper軟件進行分析，得出等位基因分型。

2 實驗結果

（1）分別加入5μL膠體金，孵育15 min后離心，沉淀及上清液檢測實驗結果見表1（“+”代表檢出，“-”代表未檢出）。

（2）分別加入10μL膠體金，孵育15 min后離心，沉淀及上清液檢測實驗結果見表2（“+”代表檢出，“-”代表未檢出）。

3 結論

實驗結果表明：200μL體系加入5μL免疫膠體金室溫下振蕩孵育15 min對接觸性DNA有足夠的吸附能力，可獲得相對較好的PCR擴增結果，本研究建立了應用免疫膠體金技術提取接觸性DNA的孵育條件，為后續運用抗-DNA多克隆抗體免疫膠體金，與DNA特異性結合，用于不同類接觸性檢材DNA提取的研究奠定了基礎。

參 考 文 獻

[1]康熙雄.免疫膠體金技術臨床應用[M].北京：軍事醫學科學出版社，2010.

[2]許欣，王鋒，等.免疫膠體金技術及其在臨床診斷上的研究進展[J].江西農業學報，2009，21（6）.

[3]朱文釧，孔繁德，林祥梅，等.免疫膠體金技術的應用及展望[J].生物技術學報，2010（4）.