甘蔗宿根矮化病多克隆抗體和免疫磁珠的制備

郭鶯 汪文華 劉黎卿 胡敏

（1. 福建省亞熱帶植物研究所 福建省生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361006；2. 華僑大學(xué)化工學(xué)院，廈門 361021）

甘蔗宿根矮化病（Ratoon stunting disease，RSD）是一種普遍存在于蔗區(qū)的世界性病害［1］，在干旱的情況下感病品種的宿根蔗產(chǎn)量損失可達(dá)50%以上［2］。1944-1945年在澳大利亞昆士蘭的甘蔗品種Q28上首次被發(fā)現(xiàn)［3］。一旦感病，植株表現(xiàn)矮化、分蘗少、蔗莖變細(xì)、節(jié)間變短等，但外表無(wú)明顯的病斑，故常常與干旱、養(yǎng)分不足等造成的生長(zhǎng)不良癥狀相混淆［4］。甘蔗宿根矮化病病原菌（Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx）為棒狀桿菌屬［5］，寄生于蔗株的木質(zhì)部導(dǎo)管中，可以侵染甘蔗屬所有已知品種，但不侵染其他植物［6］。Lxx病原細(xì)菌特別細(xì)小，分離、培養(yǎng)和檢測(cè)都極其困難，給研究帶來(lái)了很大的難度。免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic separation，IMS）是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)和分離技術(shù)。它是以抗體包被的磁珠為載體，通過(guò)抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合，形成抗原——抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場(chǎng)的作用下發(fā)生了定向移動(dòng)，從而達(dá)到分離抗原的目的。本文以感病的拔地拉為材料，從中分離獲得Lxx病原菌進(jìn)行多克隆抗體制備，并采用免疫磁珠技術(shù)標(biāo)記Lxx抗體對(duì)Lxx菌進(jìn)行富集，這樣為直接從甘蔗汁液中獲得大量純的Lxx菌用于病原菌與寄主互作研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試甘蔗 甘蔗熱帶種拔地拉由廣東省農(nóng)科院甘蔗研究室提供，種植于福建省亞熱帶植物研究所隔離溫室內(nèi)，待甘蔗成熟期取蔗莖基部為供試材料用于病原菌的分離。

1.1.2 試劑 MSC培養(yǎng)基購(gòu)于西格瑪試劑公司，BSA、弗氏佐劑購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，PCR反應(yīng)試劑、聚合酶、凝膠純化試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司，pMD-18T載體購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司，F(xiàn)eS04·7H20、FeCl3·6H20、戊二醛、硅烷化試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Lxx抗原制備 切取甘蔗莖基部，進(jìn)行表面清洗滅菌，放入超凈臺(tái)中晾干。將蔗莖切成適合大小用鑷子擠汁，4 000 r/min，離心10 min后收集蔗汁，用普通濾紙進(jìn)行初步過(guò)濾后再用0.45 μm細(xì)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。將過(guò)濾后的蔗汁100 μL涂布于含有10 μg/mL萘啶酸（Nalidixic acid）的新鮮MSC培養(yǎng)基［7］，于28℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，40 d后觀察并挑取菌落，進(jìn)行電鏡觀察和PCR驗(yàn)證。PCR引物用Pan等［8］報(bào)道的Lxx 16S-23S r DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）特異引物 Lxx1 ：5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′、Lxx2 ：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′， 產(chǎn) 物439 bp。PCR 反應(yīng)體系 ：rTaq 0.25 μL，dNTP 1 μL，10×PCR buffer（Mg2+）2 μL，正向引物 Lxx1 1 μL，反 向 引 物 Lxx2 1 μL，ddH2O 13.75 μL。PCR 擴(kuò) 增程序?yàn)?95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR回收產(chǎn)物送Invitrogen公司測(cè)序，獲得的序列在NCBI網(wǎng)站比對(duì)以確定分離的抗原是否為L(zhǎng)xx。

1.2.2 Lxx抗體制備 選取已鑒定的菌株，加入0.4%的甲醛滅活，加入弗氏佐劑，直接注射兔子，兩周注射一次，共免疫4次，二個(gè)月后抽取血清采用Protein A-Sepharose 4B 作親和層析介質(zhì)純化得到抗體蛋白，利用間接Elisa方法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，計(jì)算P/N=樣品OD值/對(duì)照OD值。若P/N≥2.1，即為陽(yáng)性。

1.2.3 免疫磁珠的制備 根據(jù)劉偉偉報(bào)道的方法［9］，利用化學(xué)共沉淀法合成硅烷化磁性Fe3O4納米粒子，，并取10 mL于干燥的表面皿中烘干至恒重，計(jì)算固形物的含量，其平均粒徑、粒徑分布和表面形貌采用透射電鏡（TEM）進(jìn)行表征；以戊二醛為交聯(lián)劑將硅烷化的磁性Fe3O4納米粒子與Lxx多克隆抗體偶聯(lián)制備免疫磁珠，取10 mg 硅烷化的Fe3O4納米粒子溶于10 mL 0.01 mol/L PH 7.4 PBS，加入 2.5 mL 25%戊二醛，于室溫下攪拌反應(yīng) 6 h。PBS 洗滌3次后用磁石收集，定容至 10 mL，加入 5 μmol抗體于37℃下攪拌 3 h，PBS洗滌3次后用磁石收集于4℃保存。

1.2.4 免疫磁珠對(duì)Lxx親合性檢測(cè) 挑取Lxx單菌落接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，48 h后4000 rmp離心棄上清，用1 mL PBS重懸浮，加入40 μL抗Lxx免疫磁珠混均，37℃孵育1h，低速離心后棄上清，用PBS緩沖液清洗2次，將分離出來(lái)的捕獲有Lxx的免疫磁珠進(jìn)行透射電鏡觀察，并利用Lxx16S引物和特異性引物進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 Lxx培養(yǎng)與鑒定

28℃培養(yǎng)40 d后，培養(yǎng)皿上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的無(wú)色、點(diǎn)狀大小的菌落，中間突起，邊緣整齊，直徑約為0.2 mm（圖1）。挑取菌落在電鏡下觀察，此菌為桿狀細(xì)菌，表面光滑，無(wú)鞭毛，大小為（0.25-0.5）μm×（1-10）μm，菌體為細(xì)長(zhǎng)形，呈直線或微彎的狀態(tài)，有部分一端膨大，有的菌體中間有隔膜存在（圖2）。隨機(jī)挑取培養(yǎng)皿上6個(gè)菌落進(jìn)行 PCR檢測(cè)，待測(cè)菌落均能擴(kuò)增出與正對(duì)照一致的目的條帶（圖3），對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)測(cè)序獲得目的片段大小為438 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)澳大利亞分離的RSD致病菌基因組相應(yīng)區(qū)段序列同源性為100%，進(jìn)化樹分析顯示其與Leifsonia xyli subsp. Xyli str. CTCB07（AE016822）關(guān)系最近，表明所分離到的即為甘蔗RSD病原菌Lxx。

圖1 病原菌Lxx純培養(yǎng)

圖2 透射電鏡下Lxx病原菌的形態(tài)觀察

圖3 菌落PCR鑒定

2.2 Lxx多克隆抗體的效價(jià)分析

利用分離的RSD病原菌Lxx免疫兔子獲得了較好的多克隆抗體（表1）。抗體稀釋到204 800倍時(shí)還有明顯的陽(yáng)性反應(yīng)，而陰性值無(wú)明顯階梯，結(jié)果表明免疫獲得的Lxx抗血清效價(jià)達(dá)大于204 800。

2.3 免疫磁珠合成與檢測(cè)

取10 mL合成的磁性Fe304懸浮液于干燥的表面皿中烘干至恒重，烘干后的質(zhì)量為0.095 g，磁珠的濃度為9.5 mg/mL。通過(guò)TEM觀察Fe304磁性粒子，結(jié)果表明納米級(jí)Fe304磁性微粒的平均粒徑在125-268 nm之間（圖4-A），球體表面均勻，有較好的形貌，分散性良好。免疫磁珠電鏡觀察結(jié)果與磁性Fe304粒子一致，無(wú)雜質(zhì)粘連，也無(wú)貼壁現(xiàn)象（圖4-B）。硅烷化后的磁性Fe304粒子與Lxx抗體偶聯(lián)，從透射電鏡圖片中看其形貌未有變化。

2.4 免疫磁珠對(duì)Lxx的親合性分析

從圖5透射電鏡照片中可以看出，免疫磁珠吸附在Lxx菌體表面，菌越密集，相應(yīng)的吸附在菌體表面的免疫磁珠也越多；低速離心后對(duì)沉淀進(jìn)行的Lxx 特異性PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖6）表明利用免疫磁珠技術(shù)獲得的Lxx分離物可用于進(jìn)一步的PCR研究。

3 討論

RSD已在各甘蔗種植國(guó)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重，是導(dǎo)致甘蔗減產(chǎn)、宿根年限縮短及嚴(yán)重威脅蔗糖產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展的一種重要病害，起初看似是一個(gè)在單一區(qū)域、單一品種上的困擾變成了一個(gè)世界范圍甘蔗產(chǎn)業(yè)的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，且已經(jīng)影響了甘蔗產(chǎn)業(yè)至少70年。RSD的致病菌的體外培養(yǎng)非常困難，盡管在1944年就發(fā)現(xiàn)，但是一直到1980年Davis［3］才成功分離培養(yǎng)。我國(guó)有關(guān)RSD病原菌分離培養(yǎng)的報(bào)道較少，2008年陳健文等［10］利用改良的SC培養(yǎng)基，從甘蔗蔗汁中分離培養(yǎng)到一種桿狀細(xì)菌，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，并結(jié)合血清學(xué)和PCR檢測(cè)方法，確認(rèn)所分離到的菌是甘蔗宿根矮化病的致病菌Lxx；2015年張小秋等［11］利用改良的MSC培養(yǎng)基成功分離Lxx，同年王麗［7］也成功分離了RSD病原菌；但目前仍然還有很多實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有辦法重復(fù)分離 Lxx，主要原因是該菌生長(zhǎng)特別緩慢，往往需要4周左右的時(shí)間才能在培養(yǎng)皿上觀察到菌落，由于培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，一旦有雜菌產(chǎn)生，分離就失敗，所以控制污染是Lxx菌分離培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有操作均在無(wú)菌超凈臺(tái)中進(jìn)行，分離過(guò)程中使用的工具和試劑均高壓滅菌處理，同時(shí)MSC培養(yǎng)基中還添加殺菌劑萘啶酸，抑制了部分雜菌的生成，一定程度上提高了Lxx分離培養(yǎng)的成功率，但相對(duì)于其它細(xì)菌的培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，這種分離培養(yǎng)的可重復(fù)性較差。免疫磁珠是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)，它將固化試劑特有的優(yōu)點(diǎn)與免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性結(jié)合于一體，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，滲透到病理、生理、藥理、微生物、生化以及分子遺傳學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，其在免疫檢測(cè)、細(xì)胞分離、生物大分子純化等方面得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，在細(xì)菌分離上也有很大的應(yīng)用前景［12-14］。在細(xì)菌分離上，與傳統(tǒng)的方法相比，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。張蓉蓉等［15］利用免疫磁珠技術(shù)分離豬胸膜肺炎放線桿菌，發(fā)現(xiàn)可以顯著提高此病原菌的分離效率；丁浩［16］在利用免疫磁珠富集法對(duì)牛源大腸桿菌O157：H7分離鑒定的研究中發(fā)現(xiàn)免疫磁珠吸附技術(shù)和普通方法相比雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著，但確實(shí)能夠增加大腸桿菌 O157：H7的分離數(shù)量；Islam等［17］利用免疫磁珠分離技術(shù)與PCR法相結(jié)合檢測(cè)志賀菌，比傳統(tǒng)的培養(yǎng)法快7 h。本研究中，利用項(xiàng)目研發(fā)的Lxx多克隆抗體制備的免疫磁珠對(duì)Lxx親合性強(qiáng)，透射電鏡觀察免疫磁珠吸附Lxx菌體的表面，并在重力作用下免疫磁珠-Lxx混合物從培養(yǎng)基中分離出來(lái)可進(jìn)一步用于PCR檢測(cè)，這為為直接從甘蔗汁液中獲得大量純的Lxx用于轉(zhuǎn)錄組或與寄主的互作研究提供了可能；利用免疫磁珠技術(shù)從甘蔗汁液中分離獲得Lxx用于病原菌的培養(yǎng)是否可以減少菌培養(yǎng)過(guò)程中的污染，提高培養(yǎng)成功率還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)。另外，項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該菌存在退化現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基PH值和培養(yǎng)溫度都不能改善其退化現(xiàn)象，推測(cè)目前的分離培養(yǎng)基還不是最適的配方，今后應(yīng)對(duì)Lxx的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。

表1 Lxx多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定結(jié)果

圖4 納米級(jí)Fe304磁性微粒和免疫磁珠的透射電鏡圖片

圖5 透射電鏡下免疫磁珠對(duì)Lxx的親合性分析

圖6 免疫磁珠與Lxx菌液免疫反應(yīng)的分離物PCR檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

通過(guò)從感病蔗汁中分離培養(yǎng)的RSD致病菌，免疫獲得了效價(jià)較高的Lxx多克隆抗體，制備的免疫磁珠對(duì)Lxx親和性強(qiáng)，能夠快速實(shí)現(xiàn)Lxx的分離，實(shí)驗(yàn)證明可進(jìn)一步用于PCR檢測(cè)，為L(zhǎng)xx與甘蔗互作時(shí)期下甘蔗感病性檢測(cè)和病原菌的富集提供了便捷高效的技術(shù)手段。

［1］G. 休茲, E. V. 阿伯特, C. A. 韋斯默, 等. 世界甘蔗病害（第二卷）［M］. 北京：農(nóng)業(yè)出版社, 1982.

［2］Bailey R, Bechet G. Further evidence of the effects of ratoon stunting disease on production under irrigated and rained condition［J］.Pro S African Sugar Tech, 1997, 71（6）：97-101.

［3］Davis MJ, Gillaspie AG, Harris RW, et al. Ratoon stunting disease of sugarcane：Isolation of the causal bacterium［J］. Science, 1980,210（4476）：1365-1367.

［4］James G. A review of ratoon stunting disease［J］. Sugar Cane, ,1997, 1174（4）：532-541.

［5］Davis MJ, Gillaspie AGJ, Vidaver AK, et al. Clavibacter：a new genus containing some phytopathogenic coryneform bacteria,including Clavibacter xyli subsp. xyli sp. nov. subsp. nov. and Clavibacter xyli subsp. cynodontis subsp. nov. pathogens that cause ratoon stunting disease of sugarcane and bermudagrass stunting disease［J］. International Journal of Systematic Bacteriology,1984, 34（2）：107-117.

［6］Rao GP, Singh M, Singh HN . Alternative hosts of sugarcane diseases［J］. Sugar Cane, 1990, 2（2）：77-81.

［7］王麗, 張劍亮, 王繼華, 等. 甘蔗品種RSD感病性檢測(cè)及RSD病原菌分離培養(yǎng)［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 42（9）：62-66.

［8］Pan YB, Grisham MP, Burner DM. A polymerase chainreaction protocol for the detection of Clavibacter xyli subsp. xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting disease［J］. Plant Disease,1998, 82（3）：285-290.

［9］劉偉偉, 孫秀蘭, 張銀志, 等. 超順磁性免疫磁珠體系用于植物油中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)研究［J］. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2011, 30（12）：1345-1350.

［10］陳健文, 劉睿, 沈萬(wàn)寬, 等. 廣東甘蔗宿根矮化病菌的分離培養(yǎng)及鑒定［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, （8）：68-70.

［11］張小秋, 梁永檢, 唐云仙, 等. 甘蔗宿根矮化病菌形態(tài)特征及其對(duì)甘蔗光合作用的影響［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 34（5）：42-47.

［12］杜英, 阮麗榮, 楊波, 等. 免疫磁珠法分離和純化人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞［J］. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2003, 38（1）：13-15.

［13］高濤, 張克儉, 張麗萍, 等. 免疫磁珠富集--實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)生畜肉中大腸埃希菌：的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制, 2016,32（11）：1184-1186.

［14］楊金玲, 黃大亮, 李莉, 等. 玉米細(xì)菌性枯萎病菌納米磁標(biāo)記免疫層析檢測(cè)試劑與試紙條［J］. 化學(xué)試劑, 2015, 37（6）：519-523.

［15］張蓉蓉, 梁望旺, 方兵兵, 等. 免疫磁珠技術(shù)分離豬胸膜肺炎放線桿菌［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2008, 39（3）：343. 348.

［16］丁浩, 蘇戰(zhàn)強(qiáng), 夏利寧, 等. 免疫磁珠富集法對(duì)牛源大腸桿菌O157：H7 分離鑒定的影響［J］. 中國(guó)畜牧獸醫(yī) , 2017, 44（4）：1189-1194.

［17］Islam D, Tzipori S, Islam M. Rapid detection of Shigella dysenteriae and Shigella tiexneff in faeces by an immunomagnetic assay with monoclonal antibodies［J］. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1993,12（1）：25-32.