煙草HD-ZIP轉錄因子HD20的克隆及纖維分化功能的研究

高潔 佟碩秋 鐘杰 貢獻 吳擁軍

（貴州大學生命科學學院，貴陽 550025）

同源異型域-亮氨酸拉鏈（Homeodomain-leucine zipper，HD-Zip）是植物特有的轉錄因子，包含一個高度保守的同源異型結構域HD，HD羧基末端緊連著一個亮氨酸拉鏈結構域［1］。研究發(fā)現(xiàn)，HDZip轉錄因子通過抑制或促進細胞的增殖、分化和生長，參與器官、維管束及分生組織的形成，調控原形成層細胞的活動及形成層細胞和維管束細胞的分化，同時還可調控激素合成及外界環(huán)境的響應［2～4］。HD-Zip轉錄因子已在多種草本植物及木本植物中被證明與纖維調控有關。單淳敏［5］在2014年鑒定到在纖維快速伸長期特異表達的HD-Zip類轉錄因子GhHOX3，該基因在棉纖維伸長的過程中發(fā)揮決定性作用。阿拉姆等［6］證明編碼來自長蒴黃麻和圓果種黃麻的同源框-亮氨酸拉鏈蛋白hat22能夠修飾，優(yōu)選地增加或增強纖維長度。Du等［7］在2011年證明HD-ZIP類轉錄因子PtHB7在楊樹次生木質部的分化調控中起重要作用，是調控楊樹木質部分化的關鍵基因。根據(jù)DNA結合特異性、基因結構等特征可將HD-Zip分為HD-ZipⅠ-Ⅳ4個亞家族，主要參與植物的激素、光信號、逆境應答反應以及器官發(fā)育的調控［8，9］。其中，HD-ZipⅢ已被證明參與調控維管組織纖維調控。Zhong等［10］在1999年發(fā)現(xiàn)擬南芥中的5個HD-ZipⅢ基因在原形成層細胞和木質部細胞中特異表達，發(fā)現(xiàn)顯性突變體rev-10d/avb1和phb-1d的木質部包圍韌皮部且維管束數(shù)目顯著增多的現(xiàn)象。王瑞等［11］通過不同組織中表達譜的分析表明，大多數(shù)HD-ZipⅣ基因優(yōu)先在發(fā)育中的胚珠和纖維中表達，從而意味著該基因家族可能參與纖維發(fā)育。但HD-ZipⅠ家族中尚未報到與維管組織纖維調控有關。最初鑒定到的HD20屬于HD-Zip型Ⅰ家族，其表達與干旱和創(chuàng)傷等多重誘導相關的刺激有關［12］。目前，有關煙草HD20結構及分子生物學功能的研究鮮見報道。吳擁軍等［13］在2009年將CHIFN-γ轉入煙草中，發(fā)現(xiàn)轉ChIFN-γ煙草具有顯著的抗蟲效果，且莖部維管束較對照發(fā)達。該實驗室前期通過顯著差異基因的GO和Pathway分析，從轉ChIFN-γ煙草中篩選獲得抗蟲相關候選基因HD20?；蛐酒Y果顯示轉基因煙草在2個不同生長時期中HD20均顯著的上調表達［14］。因此，推測轉ChIFN-γ煙草莖部纖維細胞的分化與HD20的上調表達有關。本研究利用RT-PCR克隆技術，從煙草中克隆HD20的cDNA序列，對該基因及編碼蛋白氨基酸進行序列分析，同時構建含 HD的過表達載體pSH737-HD并將其遺傳轉化至擬南芥，通過石蠟切片觀察其組織變化，為研究HD功能提供了一定的理論依據(jù)，為進一步研究目的基因在引起植物抗蟲反應中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型煙草K326（Wild Nicotiana tabacum）組織樣本為哥倫比亞野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana），由貴州省煙科院提供。植物表達載體pSH-737、農(nóng)桿菌EHA105為本分子生物學實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中Homeodomain 20 transcription factor（HD20）mRNA（Accession：HM107874）序列設計引物（HD20 F：5′-ATGTTTGATGGAGGGGAATTTTC-3′；HD20 R ：5′-TCAAGACCAGAAATCCCACCACT-3′），由 TaKaRa（大連）公司合成，預擴增片段長度約762 bp。

1.2.2 總RNA的提取和純化 煙草葉片總RNA的提取按照TRIZOl? Reagent試劑盒的操作提取［15］。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整度。

1.2.3 HD20的克隆及序列分析 以煙草總RNA為模板，Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒一步法直接擴增目的片段，RT-PCR體系為50 μL，包括10 mmol/L上下游引物各2 μL、2×1 Step Buffer 25 μL、Prime Script 1 Step Enzyme Mixc2 μL 和 RNA模板小于1 μg；反應程序為50℃反轉錄30 min，5℃2 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，循環(huán) 30 次；72℃ 10 min。RT-PCR產(chǎn)物進行純化、連接、轉化。通過菌落PCR與質粒PCR驗證，陽性菌液于寶生物公司（大連）測序。

利用Protscale在線軟件對編碼蛋白進行疏水性分析。通過NCBI在線軟件Conserved domain對結構域進行預測，BLASTXP進行氨基酸同源性分析。CLUSTALW進行氨基酸多序列比對。MEGA 6軟件包中的構建系統(tǒng)發(fā)育樹。Signal P 4.1進行信號肽分析。TMHMM2.進行跨膜結構分析。Plant-PLoc進行亞細胞定位預測。SOPMA預測氨基酸序列的二級結構。MEGA6軟件進行氨基酸序列進化樹分析。

1.2.4 表達載體的構建及擬南芥遺傳轉化 將含XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位點的引物HD MF/HD MR從含有目的基因的T載體上進行PCR擴增，膠回收后與酶切處理后的pSH-737表達載體連接轉化。通過菌落PCR檢測，挑取檢測結果為陽性的菌落提取質粒，用Hind Ⅲ/XhoⅠ進行雙酶切驗證，擬南芥遺傳轉化采用農(nóng)桿菌介導法，具體步驟參照徐錦濤等［16］。

1.2.5 石蠟切片 參照蔡雁峰［17］方法選取野生型及轉基因擬南芥新鮮植株相同部位進行石蠟切片。

2 結果

2.1 HD20的克隆

利用引物HD20 F/HD20 R對目的基因進行RTPCR擴增（圖1），獲得一條符合預期大小的目的條帶，測序為762 bp，符合預期結果。

圖1 煙草HD20的RT-PCR擴增

2.2 HD20的生物信息學分析

HD20的CDS全長762 bp，編碼253個氨基酸，堿基A、G、T和C的含量分別為32.68%、23.88%、27.30%和16.14%，其中（G+C）所占百分比為40.03%。氨基酸序列分析表明，HD20成熟蛋白的分子式為C1262H1960N352O420S9，分子量為29072.09 kD，理論等電點為4.91，穩(wěn)定系數(shù)為51.26，是一類不穩(wěn)定蛋白，脂溶性指數(shù)為62.09，親水性平均數(shù)為-0.967，無跨膜結構域，說明該蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白；蛋白質結構域預測顯示，包含2個高度保守結構域：同源異型結構域HD20（45-95）以及緊隨HD20羧基末端的亮氨酸拉鏈結構域（97-124）（圖2）。因此HD20屬于HD-Zip家族；亞細胞定位顯示該蛋白定位于細胞核中（圖3）；同時，HD20蛋白的二級結構表明，該蛋白是由37.15%的不規(guī)則卷曲、43.08%的α螺旋、10.67%的延伸鏈和9.09%的β轉角組成，因此α螺旋為該蛋白二級結構的主要成分。

氨基酸同源序列比對（圖4）顯示，HD20與煙草基因ATHB-12-like同源性一致為100%。ATHB12屬于同源結構域-亮氨酸拉鏈Ⅰ類（HD-ZipⅠ）基因，HD20屬于HD-ZipⅠ亞家族。與其他高等植物ATHB-12-like基因氨基酸比對結果顯示，HD20編碼的氨基酸序列與辣椒（XP 016538251.1）、馬鈴薯（XP_006339757.1）、 番 茄（XP_004230017.1）、棉花（XP_017629690.1）、番茄（EOX95622.1）、棗（XP_015888788.1） 大豆（XP_003528775.1）和綠豆（XP_014524102.1）編碼的氨基酸序列具有較高的同源性，分別為74%、72%、69%、68%、62%、61%和58%。說明HD20編碼的氨基酸與各植物中ATHB-12-like編碼的氨基酸序列存在較高的同源性。采用MEGA6軟件將HD20編碼的蛋白序列與辣椒、番茄和馬鈴薯等9種植物的ATHB-12-like蛋白序列進行進化樹分析，發(fā)現(xiàn)其與同一茄科植物的親緣關系最接近；與棉花、棗以及胡楊等親緣關系比較接近；與擬南芥的親緣關系最遠。

圖2 煙草HD20轉錄因子蛋白保守結構域

圖3 煙草HD20的亞細胞定位

使用軟件CLUSTALW對HD20與其他植物ATHB-12氨基酸進行多序列比對（圖5），發(fā)現(xiàn)HD20與不同物種間ATHB-12-like編碼蛋白在同源異型結構域以及亮氨酸拉鏈結構域存在較高的保守型，說明在該類轉錄因子中這些保守結構域至關重要，因此進化上較保守。

圖4 基于氨基酸序列的HD20轉錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 HD20保守結構域序列對比

2.3 HD20的表達載體構建及遺傳轉化

構建真核表達載體pSH737-HD，采用農(nóng)桿菌介導轉化法將HD20轉化至擬南芥（圖6），并對轉基因植株進行GUS染色，保存陽性植株，以便后續(xù)實驗。

2.4 轉HD20擬南芥的組織的石蠟切片分析

通過石蠟切片檢測轉HD20擬南芥組織的差異，發(fā)現(xiàn)莖部木質部較對照發(fā)達。結果（圖7）表明，HD20與擬南芥的纖維分化有關，推測HD20在擬南芥纖維分化過程中的重要作用。

圖6 HD20的遺傳轉化

圖7 轉HD20擬南芥石蠟切片

3 討論

煙草HD20與植物激素的表達調控相關，但其在纖維分化中的作用未見報道。本研究克隆獲得煙草HD20完整編碼區(qū)的cDNA序列，其推導的氨基酸序列與其他植物同源蛋白的氨基酸序列有保守的特異性序列和較高的序列相似性，其中與辣椒ATHB-12-like基因的氨基酸序列同源性最高，達74%，具有潛在的生物學意義。結構域是生物大分子體現(xiàn)特異結構和獨立功能的基礎，分析其編碼的蛋白序列發(fā)現(xiàn)其具有典型的亮氨酸拉鏈結構和同源異型結構域，由此推斷該蛋白屬于HD-Zip家族。迄今為止，國內外對煙草HD的克隆研究較少。Re等［18］在2011年對煙草 NaHD20（HM107874.2）進行克隆，獲得基因長度為1 091 bp，與本研究得到HD20序列相似度為96%。煙草HD20的克隆有助于闡明不同HD20的關系及豐富HD-Zip家族成員。此外，本研究將煙草HD20遺傳轉化至擬南芥，石蠟切片結果顯示，莖部維管束發(fā)生改變，木質部較對照更發(fā)達，表明該基因與維管組織纖維細胞的分化相關，推測該基因參與擬南芥纖維組織分化的代謝調控，在纖維細胞分化機制中發(fā)揮調控作用。因此，轉ChIFN-γ煙草中HD20的上調表達是轉基因煙草莖部維管束增加的直接因素。

維管組織是陸生植物主要的特征結構，為植物向上生長提供機械支撐，具有運輸營養(yǎng)物質、水分及信號分子的作用。維管束由木質部、形成層和韌皮部 3種組織組成。Sachs［19］和 Aloni［20］已經(jīng)開創(chuàng)了維管組織分化的生理研究，發(fā)現(xiàn)纖維形成誘導所需的信號來自幼葉。Zhong等［21］在1999年證明IFL1調控擬南芥中的間質纖維分化，編碼同源二聚體-亮氨酸拉鏈蛋白，HD-Zip蛋白在間質細胞和維管束中表達，證明HD-Zip蛋白具有調控植物纖維細胞分化的作用。Manavella等［22］發(fā)現(xiàn)HD20具有調節(jié)植物激素產(chǎn)生的功能，尤其是對JA和ET的正調控，HD20還可對ET的敏感性及SA的積累起負調控作用。本研究表明HD20對煙草及擬南芥的維管束組織纖維分化具有調控作用。因此，推測HD20編碼的HD-Zip蛋白參與植物的生長發(fā)育，對植物激素的產(chǎn)生具有調節(jié)功能，或者影響植物體內與激素相關的表達調控，從而導致纖維細胞發(fā)生改變。

為了更加明確地驗證HD20與植物體內纖維分化的調控有關，后續(xù)可將轉HD20擬南芥進行激素測定以及研究其是否在內分泌或維管束狀纖維具有差異表達，進一步為HD-Zip蛋白在纖維分化的調控提供直接證據(jù)，為HD20的功能研究提供理論依據(jù)。

4 結論

克隆獲得HD20的cDNA序列，其蛋白序列具有典型的亮氨酸拉鏈結構和同源異型結構域，推測屬于HD-Zip家族。HD20對煙草及擬南芥的維管束組織纖維分化具有調控作用。

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