不同信號肽及分子伴侶對中性蛋白酶在枯草芽孢桿菌中分泌表達的影響

楊何寶 胡美榮 鄭翔 牟慶璇 高沛汝

（1. 河北省微生物研究所，保定 071051；2. 中國科學院微生物研究所 微生物生理與代謝工程重點實驗室，北京 100010）

傳統的制革工藝會產生大量污染，其中，以脫毛環節產生的污染最為嚴重［1］。近年來研究的清潔脫毛工藝主要有酶法脫毛［2］、灰堿法基礎上的保毛脫毛、有機胺脫毛、過氧化氫氧化脫毛等方法［3］。其中，蛋白酶法脫毛因條件溫和，對真皮中角蛋白水解少，且毛可回收，是目前為止最有可能代替灰堿法實現清潔脫毛工業化的方法［4］。然而酶法脫毛也有一些缺點，如酶蛋白質量不穩定、純度較低、專一性差等，會造成小毛脫不凈或爛面、松面、毛孔擴大等問題，尤其是酶系中含有水解皮膠原的膠原蛋白酶，在大規模應用中如工藝控制不嚴會造成松面、爛皮現象［5］。因此酶脫毛在實際生產過程中的操作控制難度較大。但從環保角度出發，酶法脫毛仍然是未來脫毛技術清潔化的發展方向。

近年來，國內外的一些學者關于信號肽載體構建［6-10］和分子伴侶共表達［11-14］來提高外源蛋白在宿主菌中的表達做了很多研究。研究表明，針對不同的蛋白質應該選擇合適的信號肽來實現有效的分泌表達。Nagarajan等［15］選擇了4 種不同的酶蛋白信號肽，以芽孢桿菌 BE1510 為宿主菌，分別表達重組鏈霉抗生物素蛋白（Streptavidin），結果中性蛋白酶信號肽的分泌效率最高；Brockmeier等［16］嘗試了來源于枯草芽孢桿菌的 173 種信號肽對角質酶分泌表達的影響，其中有 39 種信號肽不能實現角質酶的分泌。研究表明，分子伴侶能夠幫助蛋白正確折疊，提高蛋白的可溶性表達，減少包涵體的形成。Pfeffer等［17］在E. coli表達目的蛋白的同時表達分子伴侶蛋白，提高了目的蛋白的可溶性表達比例；陳飛等［18］的研究表明，在搖瓶中，相對于無分子伴侶的菌株，單獨整合分子伴侶PDI 及同時整合分子伴侶Ero1、PDI 菌株的CiP 酶活分別提高了2.43 和2.62 倍，活力達到316 U/mL 和340 U/mL。

鑒于此，本研究室前期構建了一株產中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株WB800N/pHT43-npr［19］，酶法脫毛與傳統的灰堿法效果相當，并且該菌株剔除了膠原蛋白酶基因，不表達膠原蛋白酶，不會造成松面、爛皮、毛孔擴大等問題。但是，該菌株中性蛋白酶幾千的酶活表達能力較野生菌上萬的酶活力還有很大差距，在實際應用中成本較高，難以實現規模化生產。因此，在原有研究的基礎上，本研究擬通過篩選信號肽和整合分子伴侶來提高中性蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達，有助于實現重組中性蛋白酶的工業化生產，進而促進清潔化脫毛工藝的推廣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 本實驗所用菌株與質粒及其相關特性描述見表 1。大腸桿菌 T1 用于質粒的擴增和PCR 片段的克隆。解淀粉芽孢桿菌 AS1.398作為供體菌，WB800N 作為宿主菌。

表1 菌株與質粒

1.1.2 主要試劑和儀器 高保真DNA mix聚合酶，購自MCLAB公司；限制性內切酶Xma I、BamH I、高保真DNA組裝預混液、膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自NEB公司；DNA maker、Protein maker購自Thermo公司；IPTG購自天根公司；Yeast和Tryptone購自OXOID公司；其他為國產分析純試劑；PCR 儀購自東勝創新生物科技有限公司；核酸電泳儀購自北京六一公司；蛋白電泳儀購自君意公司；凝膠成像儀購自天能公司；引物合成和DNA 測序由北京擎科生物科技公司完成。

1.1.3 培養基 LB培養基（L）：10 g 胰蛋白胨，5g 酵母粉，10 g NaCl，121℃ 滅菌 20 min ；固體培養基加20 g/L 的瓊脂粉。牛奶平板培養基（L）：脫脂奶粉20 g，瓊脂20 g，115℃滅菌20 min。

1.1.4 PCR引物 本實驗所用PCR引物見表2。

1.2 方法

常規分子生物學操作參照《分子克隆手冊》［20］。

1.2.1 不同信號肽重組質粒的構建 以pHT43-npr重組質粒為模版，設計特定引物QC-F和QC-R進行PCR，去除質粒上原有的信號肽基因，得到新的質粒命名為pHT43-npr-N；然后，采用Quick Change引物設計方法，設計5組信號肽引物（表2，signal peptide primer），以pHT43-npr-N為模版進行PCR，得到5個重組質粒，分別為pHT43-npr-aprE、pHT43-npr-sacB、pHT43-npr-nprE、pHT43-npr-amyE、pHT43-npr-yncM。

1.2.2 不同分子伴侶重組質粒的構建 （1）克隆分子伴侶基因PrsA和DnaK：以枯草芽孢桿菌AS1.398基因組為模版，設計兩組分子伴侶引物進行PCR（表2，molecular chaperone primer），核酸電泳驗證，使用膠回收試劑盒回收分子伴侶片段。（2）質粒酶切和新重組質粒的構建：對pHT43-npr質粒進行BamH I和Sma I雙酶切，得到pHT43片段和npr片段；再以npr片段和分子伴侶片段為模版，設計連接引物進行PCR（表2，connected primer），得到npr+分子伴侶片段；最后采用Gibson連接方法將pHT43片段和npr+分子伴侶片段進行連接，得到新的重組質粒。

1.2.3 重組質粒轉化到大腸桿菌T1中 重組質粒采用熱激法進行轉化，然后涂布于LB固體平板（含100 μg/mL氨芐青霉素），37℃過夜培養。

1.2.4 菌液PCR初步鑒定 用移液搶挑取轉化子單克隆至LB液體培養基中培養6-8 h后，進行菌液PCR。菌液PCR引物如表2。反應結束后將PCR產物進行1%瓊脂糖電泳檢測驗證，驗證正確的菌落。

由于信號肽片段較短，無法通過此方法進行驗證，所以直接測序驗證。

表2 引物序列

1.2.5 重組質粒DNA測序及檢驗實驗的正確性 將菌落PCR鑒定為陽性克隆的轉化子進行5 mL LB液體試管培養12-16 h，并送往擎科生物（北京）股份有限公司進行DNA測序，測序引物如表2（sequencing primer）；將測序后獲得的序列用DNAMAN軟件進行比對以驗證序列的正確性和該方法的可靠性。

1.2.6 轉化枯草芽孢桿菌WB800N 將驗證正確的菌株37℃培養8-12 h，用NEB公司Plamid Miniprep Kit試劑盒小量提取質粒，取10 μL質粒加入到400μL枯草芽孢桿菌WB800N感受態中，37℃，220 r/min培養2 h；涂布于LB固體平板（含10 μg/mL氯霉素），37℃過夜培養。

1.2.7 牛奶平板初步驗證 用移液槍挑取轉化子于牛奶平板驗證中性蛋白酶活性，37℃培養1-3 h，有水解圈生成的菌落即為陽性轉化子。

1.2.8 重組菌株表達中性蛋白酶酶活性的測定及蛋白電泳分析 將對照菌株（WB800N/pHT43-npr）與重組菌株按4%的比例接種于10 μL/mL CmR的50 mL LB液體培養基中，37℃、180 r/min培養。當菌體OD600=0.5左右時，添加1‰IPTG誘導產酶，誘導24 h后取樣，采用Folin-酚法測定中性蛋白酶酶活性，并對重組菌株表達的中性蛋白酶進行SDSPAGE電泳分析。

圖1 pHT43-npr-N質粒電泳分析

2.1.2 不同信號肽重組質粒構建、轉化大腸桿菌T1、酶切及測序結果驗證 由圖2可知，5個重組質粒經過雙酶切電泳后，均有兩條特異性條帶，并且中性蛋白酶基因npr的條帶位置正確；同時，測序結果用DANMAN進行比對，5個信號肽片段測序結果與實際序列完全重合，說明了重組質粒構建成功，并成功轉化到大腸桿菌T1中。

2.1.3 不同信號肽重組質粒轉化枯草芽孢桿菌WB800N及牛奶平板驗證結果 由圖3可知，與對照菌株（WB800N/pHT43-npr）相比，5株重組菌株涂牛奶平板后雖有菌落生成，但均無水解圈生成，說明5株菌沒有分泌中性蛋白酶。

2.1.4 不同信號肽重組菌株中性蛋白酶酶活驗證結果 以LB液體培養基作為發酵培養基，通過添加誘導劑IPTG進行誘導產酶，24 h后測酶活性。由表3可知，兩株重組菌株的發酵酶活性均顯著低于對照菌株（WB800N/pHT43-npr），3株重組菌株不表達中性蛋白酶。

圖2 不同信號肽重組質粒雙酶切電泳驗證

圖3 不同信號肽重組菌株涂牛奶平板結果

2 結果

2.1 不同信號肽重組質粒的構建、驗證、轉化及誘導表達結果

2.1.1 pHT43-npr質粒中原有信號肽基因剔除的結果 以pHT43-npr質粒為模版，設計引物進行PCR剔除原有的信號肽序列，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果（圖1）顯示，pHT43-npr-N質粒的基因大小為9 428 bp，條帶清晰，無雜帶，與預期結果一致。

2.2 不同分子伴侶重組質粒的構建、驗證、轉化及誘導表達結果

2.2.1 克隆分子伴侶基因PrsA和DnaK結果 分子伴侶PrsA片段基因長度為876 bp，DnaK片段長度為1 836 bp，兩個分子伴侶位置條帶正確（圖4）。

2.2.2 構建新重組質粒并轉化大腸桿菌T1酶切驗證結果 npr+PrsA片段基因長度為2 352 bp，npr+DnaK片段基因長度為3 312 bp。由圖5可知，通過菌液PCR、核酸電泳驗證，兩條片段在相應位置均有特異性條帶，且大小與預期相符。

表3 不同信號肽重組質粒誘導發酵24 h酶活測定結果

圖4 克隆分子伴侶片段電泳驗證

圖5 菌液PCR驗證電泳圖

2.2.3 不同分子伴侶重組質粒轉化枯草芽孢桿菌WB800N及牛奶平板驗證結果 由圖6可以看出，牛奶平板有水解圈生成，說明菌落周圍有中性蛋白酶存在。

2.2.4 不同分子伴侶重組菌株中性蛋白酶酶活驗證及蛋白電泳分析結果 由圖7可知，兩株重組菌株和對照菌株在30-40 kD之間均有一條特異性條帶，說明兩株重組菌株成功后表達了中性蛋白酶。與對照菌株相比，兩株重組菌株發酵酶活都有所增加，分別增加了23%和33%（圖8）。

圖6 不同分子伴侶重組菌株涂牛奶平板結果

圖7 不同重組菌株中性蛋白酶SDS-PAGE結果

圖8 不同重組菌株發酵酶活對比結果

3 討論

隨著制革業對清潔化生產工藝的需求，酶法脫毛制革因酶制劑來源廣泛、易獲得、無毒害和污染小等優點成為替代傳統灰堿法脫毛工藝的首選［21-22］。目前市場中的脫毛酶如1398中性蛋白酶和來源于其他枯草芽孢桿菌的中性蛋白酶，雖然可以完成脫毛工藝，但是酶制劑中有膠原蛋白酶的存在，會造成皮面爛面、毛孔粗大等問題，使得酶法脫毛很難在制革工藝中規模化推廣。目前大多數研究集中在菌株發酵條件優化［23-24］、菌種誘變選育［25-26］和不同外源系統表達［27-28］等技術來提高中性蛋白酶的表達上。雖然這些技術能在一定程度上提高酶的產量，但利用信號肽和分子伴侶來提高中性蛋白酶的表達還罕見報道。枯草芽孢桿菌表達系統已經是一種成熟的外源蛋白表達系統，本研究選用的宿主菌為剔除膠原蛋白酶基因的枯草工程菌株WB800N，從源頭上消除了膠原蛋白酶對皮膠原的影響。然而外源蛋白在進行分泌表達過程中往往水平較低，大量研究表明［15-18，29-36］，選擇適合的信號肽和分子伴侶可以提高蛋白的表達。本文通過篩選信號肽和整合分子伴侶兩種技術手段，來提高中性蛋白酶基因（npr）的胞外表達。構建的5株信號肽重組菌株雖然不能表達中性蛋白酶，但對以后的科研提供了一定的參考；成功構建的2株整合分子伴侶的重組質粒對中性蛋白酶的表達均有一定的提高，整合PrsA和整合DnaK使目的蛋白酶活分別提高了23%和33%，說明兩個分子伴侶成功地幫助了中性蛋白酶基因進行更快速的折疊和組裝。

本研究通過篩選信號肽和整合分子伴侶促進蛋白轉運和正確折疊從而提高中性蛋白酶表達量，為該酶的工業化生產及應用打下基礎，對促進其他外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌表達提供了新的思路和借鑒。本文通過研究信號肽和分子伴侶對中性蛋白酶分泌表達的影響，得到了一些有意義的結果，但仍有一下幾方面有待進一步研究：

（1）重組菌株 WB800/pHT43-npr-PrsA和 WB-800/pHT43-npr-DnaK的發酵培養采用的是 LB 培養基，為了提高分泌量，可以對培養基成分及發酵條件進行優化；（2）本研究僅選取了 5種信號肽來替換原始信號肽amyQ 基因，得到的結果不理想。下一步研究可選取更多具有代表性的信號肽或者以高通量的手段建立載體庫，系統化的分析在不同信號肽的引導下，具有不同結構蛋白質分泌效率的規律；（3）本研究只做了整合一種分子伴侶重組菌株的構建，對于整合兩種或多種分子伴侶對目的蛋白的分泌表達的影響可作為將來的研究方向；（4）本文未對重組酶的酶學性質和應用做進一步研究，此可作為下一步的研究方向。

4 結論

通過篩選信號肽和整合分子伴侶到重組質粒上，成功構建了兩株整合分子伴侶的重組菌株，中性蛋白酶發酵酶活比對照分別提高了23%和33%。

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