黑果腺肋花楸花色苷提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性和組成鑒定

位路路，林 楊，王月華，孟憲軍*

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）是一種多酚類物質(zhì)含量極高的獨(dú)特漿果，也是水果和漿果中清除自由基的佼佼者[1]。Zheng Wei等[2]通過(guò)氧自由基吸收能力測(cè)定法測(cè)得黑果腺肋花楸比藍(lán)莓、越橘和蔓越莓的抗氧化活性高出幾倍；文獻(xiàn)[3-4]通過(guò)對(duì)黑果腺肋花楸與9 種黑莓、3 種樹莓、9 種黑加侖、4 種紅加侖等漿果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，黑果腺肋花楸中總酚的含量是其他漿果的數(shù)倍，而花青素含量也明顯高于以上幾種漿果。黑果腺肋花楸多酚主要為花色苷、黃酮和酚酸，其中花色苷約占總酚含量的25%[5]。

花色苷等活性物質(zhì)生物利用度比較低，但是有足夠的證據(jù)已經(jīng)證明黑果腺肋花楸花色苷具有抗氧化、減少血漿膽固醇、改善血糖[6]、抗炎、抗尿道感染、心臟保護(hù)、肝保護(hù)[7]、抗誘變[5]和抗癌[8]等功能[9-10]，所以采用有效的方式提取純化花色苷是非常必要的[11]。Jakobekd[12]及Wangensteen[13]等已對(duì)不同產(chǎn)地不同品種的黑果腺肋花楸提取物成分做了鑒定，在此基礎(chǔ)上對(duì)于剛引進(jìn)中國(guó)栽培的黑果腺肋花楸花色苷提取物的成分探究也是必不可少的。本實(shí)驗(yàn)在料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲功率和pH值單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑果腺肋花楸花色苷提取條件，所得提取物經(jīng)過(guò)XAD-7大孔樹脂純化后冷凍干燥制成粉末，通過(guò)對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) radical，ABTS+·）清除能力及Fe3+還原能力（ferric reducing-antioxidant power，F(xiàn)RAP）方法評(píng)價(jià)黑果腺肋花楸花色苷粗提物的抗氧化性能，并且采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)花色苷組成進(jìn)行定性分析和鑒定。

目前國(guó)外的研究主要集中在黑果腺肋花楸中的花色苷對(duì)疾病的預(yù)防和干擾功能等領(lǐng)域，而國(guó)內(nèi)的研究還不多見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)旨在為提高黑果腺肋花楸花色苷提取物的含量及抗氧化性評(píng)價(jià)方面提供理論支持，并且對(duì)該果以后的推廣及功能性研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸鮮果購(gòu)于遼寧省鞍山市，品種為“富康源1號(hào)”，放于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?。ABTS+·試劑盒、FRAP試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；DPPH 美國(guó)Sigma公司；鹽酸、氯化鉀、無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、VC、福林-酚試劑、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；BT-100B數(shù)顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；美的攪拌機(jī)、電子分析天平、PHS-3C型pH計(jì) 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV-5800型紫外-可見(jiàn)分光光度儀 上海元析儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；真空冷凍濃縮系統(tǒng) 美國(guó)Labconco公司；高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；酶標(biāo)儀美國(guó)博騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸花色苷的超聲波輔助提取

挑選品質(zhì)良好的黑果腺肋花楸凍果，并放置常溫解凍后勻漿，準(zhǔn)確稱取5.00 g黑果腺肋花楸勻漿液，按一定比例加入酸性乙醇溶液，密封后放入超聲波清洗機(jī)中提取花色苷。抽濾后，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，將提取液避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 花色苷含量的測(cè)定

參照Szymanows等[14]的方法，根據(jù)pH值示差法測(cè)定花色苷含量。將0.025 mol/L氯化鉀和0.4 mol/L乙酸鈉用鹽酸分別調(diào)制成pH 1.0和pH 4.5的緩沖液。在24 mL的緩沖液中加入1 mL樣品，振蕩搖勻，室溫條件下避光平衡15 min，并以蒸餾水作為空白對(duì)照，在510 nm和700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，按公式（1）、（2）計(jì)算花色苷含量：

式中：A510nm為pH 1.0緩沖液于510 nm波長(zhǎng)處的吸光度；A700nm為pH 1.0緩沖液于700 nm波長(zhǎng)處的吸光度；A’510nm為pH 4.5緩沖液于510 nm波長(zhǎng)處的吸光度；A’700nmpH 4.5緩沖液于700 nm波長(zhǎng)處的吸光度；Mr為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量（449.2）；df為樣品的稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積/mL；m為黑果腺肋花楸凍果的質(zhì)量/g；ε為矢車菊3-葡萄糖苷的消光系數(shù)（26 900）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

按照1.3.2節(jié)所述超聲波輔助提取黑果腺肋花楸花色苷，選取提取溫度、超聲功率、料液比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值6個(gè)因素，改變單一因素考察對(duì)花色苷提取量的影響，單因素試驗(yàn)因素與水平如表1所示，每個(gè)單因素試驗(yàn)平行重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值[15]。

表1 單因素試驗(yàn)因素與水平Table1 Coded levels of independent variables used in one-factor-at-a-time design

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇超聲時(shí)間（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）、pH值（X3）3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以花色苷含量（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定黑果腺肋花楸中花色苷的最佳提取條件，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table2 Coded levels of independent variables used in response surface design

1.3.5 花色苷的富集

參考相關(guān)文獻(xiàn)[16-18]的方法并稍作修改，采取下列步驟進(jìn)行花色苷的富集：先將XAD-7型大孔樹脂用乙醇浸泡24 h，再用酸堿處理進(jìn)行活化，采用濕法裝柱，裝入的樹脂為柱體積的2/3。吸附：以2 mL/min的流速將1 000 mL蒸餾水泵入柱內(nèi)，之后以相同流速泵入500 mL的花色苷粗提液，然后靜置吸附10～12 h；除雜：用1 500 mL的蒸餾水以5.3 mL/min的流速?zèng)_掉花色苷中的糖、蛋白質(zhì)和有機(jī)酸等雜質(zhì)；洗脫：先用70%乙醇溶液以相同的流速對(duì)花色苷進(jìn)行第1次洗脫，之后用95%的乙醇溶液進(jìn)行第2次洗脫，收集2 次洗脫液。得到的液體蒸發(fā)掉乙醇后進(jìn)行真空冷凍干燥，最終得到花色苷凍干粉，裝于2 mL試管中密封保存，置于-80 ℃冰箱中貯藏備用。

1.3.6 多酚含量的測(cè)定

采用福林-酚法[19-20]，將1.3.5節(jié)中的黑果腺肋花楸花色苷提取物粉末配制成0.05 mg/mL樣品溶液，取樣品0.5 mL，加入3 mL福林-酚試劑后避光反應(yīng)5 min，之后加入2.4 mL 7.5%的Na2CO3溶液，渦旋混勻，室溫避光放置2 h后，測(cè)定765 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)樣品（0～100 μg/mL），所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.036 2+7.076 87x（R2=0.999 2）。多酚含量按式（3）計(jì)算，結(jié)果以沒(méi)食子酸計(jì)：

式中：Y為樣品中多酚含量/（mg/g）；ρ為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得的樣品稀釋液多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為樣品總體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.7 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力

參考安小琦等[18]的方法配制DPPH工作液。根據(jù)1.3.5節(jié)所述方法得到的凍干粉和VC配成20、40、60、80、100 μg/mL質(zhì)量濃度的樣品溶液。配制反應(yīng)液：空白組A0：150 μL 80%乙醇溶液+150 μL DPPH溶液；樣品組Ai：150 μL樣品溶液+150 μL DPPH溶液；對(duì)照組Aj：150 μL樣品溶液+150 μL 80%乙醇溶液。配制完成后在室溫條件下避光反應(yīng)30～40 min后，用酶標(biāo)儀在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組反應(yīng)液的吸光度，按式（4）計(jì)算DPPH自由基清除率：

1.3.7.2 ABTS+·清除能力

參照Z(yǔ)?otek等[21]的方法略有修改。根據(jù)1.3.5節(jié)所述方法得到的凍干粉和VC配成20、40、60、80、100 μg/mL質(zhì)量濃度的樣品溶液。配制反應(yīng)液：空白對(duì)照組：200 μL ABTS工作液+10 μL蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)曲線組：200 μL ABTS工作液+10 μL各濃度Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)組：200 μL ABTS工作液+10 μL各濃度樣品。振蕩混勻，室溫下反應(yīng)6 min后測(cè)定734 nm波長(zhǎng)處吸光度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為Trolox當(dāng)量表示樣品的ABTS+·清除能力。

1.3.7.3 FRAP

參照Feng Chengyong等[22]的方法略有修改。根據(jù)1.3.5節(jié)所述方法得到的凍干粉和VC配成20、40、60、80、100 μg/mL質(zhì)量濃度的樣品溶液。配制反應(yīng)液：空白對(duì)照組：180 μL FRAP工作液+5 μL蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)曲線組：180 μL FRAP工作液+5 μL各質(zhì)量濃度FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)組：180 μL FRAP工作液+5 μL各濃度樣品。振蕩混勻，在38 ℃反應(yīng)5 min后測(cè)定593 nm波長(zhǎng)處吸光度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為Trolox當(dāng)量來(lái)表示樣品的FRAP值。

1.3.8 花色苷組成的鑒定

樣品前處理：準(zhǔn)確稱取0.01 mg樣品，溶于1 mL含有0.01%鹽酸的色譜級(jí)甲醇中，經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾，-80 ℃?zhèn)溆梅治觥?/p>

高效液相色譜測(cè)定條件：分離柱：Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：520 nm和350 nm；流動(dòng)相A：0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～40 min，0%～40% B；40～45 min，40%～45% B；45～52 min，45%～0% B。流速：0.7 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式，掃描范圍m/z 10～1 000；霧化氣壓力30 psi；干燥器流速12 L/min；閾值500；干燥器溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓3 500 V[18]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果采用 ±s表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析顯著性（P＜0.05），采用Origin 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 提取溫度對(duì)花色苷含量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on anthocyanins extraction

2.1.1 提取溫度對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取的影響

如圖1所示，隨著提取溫度的升高，黑果腺肋花楸花色苷含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)花色苷含量最高（P＜0.05）。溫度的升高使細(xì)胞內(nèi)花色苷更易溶出，提取率升高。但當(dāng)溫度過(guò)高，促使花色苷降解，含量下降[23]。

2.1.2 超聲功率對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取的影響

圖2 超聲功率對(duì)花色苷含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on anthocyanins extraction

如圖2所示，隨著超聲功率的提高，花色苷含量并沒(méi)有明顯的提高。試驗(yàn)選取80～200 W的功率范圍內(nèi)，花色苷含量沒(méi)有明顯的趨勢(shì)性（P＞0.05），花色苷含量在超聲功率為100 W時(shí)比其他略高，因此在后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，超聲功率選為100 W。

圖3 料液比對(duì)花色苷含量的影響Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on anthocyanins extraction

2.1.3 料液比對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取的影響

如圖3所示，隨著溶劑用量的逐漸提高，黑果腺肋花楸花色苷含量也逐漸上升。當(dāng)料液比在1∶30（g/mL）時(shí)，含量明顯提高（P＜0.05），但當(dāng)繼續(xù)增加提取試劑用量后，隨著乙醇溶液用量的增加，含量略有降低。說(shuō)明當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，黑果腺肋花楸中的花色苷物質(zhì)大部分已溶出。隨著料液比的變化，果渣中糖類與脂類物質(zhì)的溶出影響了多酚類物質(zhì)的提取。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響Fig.4 Effect of ultrasound time on anthocyanins extraction

如圖4所示，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷含量逐漸增加，并在30 min時(shí)出現(xiàn)最大值（P＜0.05）。而后，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷含量逐漸減小。這說(shuō)明在30 min時(shí)，花色苷含量已經(jīng)被充分提取。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，使得其中一部分花色苷被氧化、分解，導(dǎo)致提取量逐漸下降。

2.1.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取的影響

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷含量的影響Fig.5 Effects of ethanol concentration on anthocyanins extraction

如圖5所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增加，黑果腺肋花楸提取物中的花色苷含量逐漸上升，原因是高濃度乙醇擁有著高滲透力，有利于花色苷的溶出，但過(guò)高的乙醇濃度致使溶液極性過(guò)低，與弱極性花色苷不相溶[24]，所以選擇體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液（P＜0.05）。

2.1.6 pH值對(duì)黑果腺肋花楸花色苷提取的影響

圖6 pH值對(duì)花色苷含量的影響Fig.6 Effects of pH on anthocyanins extraction

如圖6所示，隨著pH值的升高花色苷含量也隨之升高，并在pH 2.0時(shí)出現(xiàn)最大值（P＜0.05），而后隨著pH值的升高花色苷含量略有下降，原因可能是過(guò)低的pH值會(huì)使糖基水解，使花色苷的穩(wěn)定性下降，pH值高于2后花色苷不穩(wěn)定顯色變淺[25]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲時(shí)間（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）、pH值（X3）3 個(gè)因素，以花色苷含量（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)[25]，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table3 Experimental design and results for response surface analysis

對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到花色苷含量（Y）的二次多項(xiàng)回歸模型為Y=3.29+0.035X1+9.341×10-3X2+0.02X3+0.029X1X2-0.014X1X3+0.037X2X3-0.068-0.19-0.20。

表4 黑果腺肋花楸花色苷含量的方差分析Table4 Analysis of variance for the effect of variables on anthocyanins content

由表4可知，該回歸模型P值小于0.000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著。R2值為0.998 1，值為0.995 6，說(shuō)明回歸方程擬合程度高，可用于黑果腺肋花楸花色苷含量的分析。該模型Y中各項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響都顯著，X1、、和是極顯著項(xiàng)，其他為顯著項(xiàng)。

由圖7可看出，超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值交互作用對(duì)黑果腺肋花楸花色苷含量的影響。根據(jù)響應(yīng)面圖的特點(diǎn)[23]，其曲線走勢(shì)相對(duì)越陡，說(shuō)明該因素對(duì)黑果腺肋花楸花色苷含量的影響越顯著。超聲時(shí)間對(duì)花色苷含量影響最顯著，pH值對(duì)花色苷含量影響較為顯著，而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷含量的影響最弱。通過(guò)響應(yīng)面圖和表4可知，影響花色苷提取的因素主次順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞pH值＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖7 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots showing the interactive effects of factors on anthocyanins content

2.2.2 最佳條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件分析得到最佳黑果腺肋花楸花色苷提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)64.33%、提取時(shí)間31.08 min、pH 2.03，但考慮到實(shí)際操作的可行性，將以上工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)64%、提取時(shí)間31 min、pH 2.0。根據(jù)此條件進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，得黑果腺肋花楸中的花色苷含量平均值為（3.61±0.01）mg/g，該實(shí)際值與理論值接近且穩(wěn)定，說(shuō)明采用響應(yīng)面優(yōu)化法得到的最佳工藝條件可靠[24]。

2.3 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除能力

圖8 花色苷和VC對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging effect of anthocyanins and VC

由圖8可知，花色苷與VC對(duì)DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而增大，且花色苷的抗氧化性比VC強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到99.09%。雖然不像ABTS+·清除能力和FRAP具有顯著差異性，但規(guī)律保持一致。

2.3.2 ABTS+·清除能力

圖9 花色苷和VC對(duì)ABTS＋·的清除能力Fig.9 ABTS+· scavenging activity of anthocyanins and VC

由圖9可以得出，花色苷與VC對(duì)ABTS+·清除能力隨質(zhì)量濃度的升高而增大，且花色苷的抗氧化性顯著高于VC（P＜0.05），在100 μg/mL時(shí)花色苷清除ABTS+·的能力相當(dāng)于2.5 倍的Trolox和2 倍的VC。

2.3.3 FRAP

圖10 花色苷與VC的FRAP值的測(cè)定Fig.10 Determinatim of FRAP value of anthocyanins and VC

由圖10可以得出，花色苷與VC的FRAP隨質(zhì)量濃度的升高而增大，且花色苷的抗氧化性顯著高于VC（P＜0.05），在100 μg/mL時(shí)花色苷FRAP相當(dāng)于2.5 倍的Trolox和4 倍的VC。

2.4 黑果腺肋花楸提取物花色苷組成成分的分析

圖11為黑果腺肋花楸花色苷提取物色譜圖，共有5 個(gè)峰，圖12～14分別為峰1、峰2和在液相色譜圖中未檢測(cè)到峰的矢車菊-3,5-二己糖苷的質(zhì)譜圖。

圖11 黑果腺肋花楸提取物中花色苷高效液相色譜圖Fig.11 HPLC prof i les of anthocyanins from A. melanocarpa extracts

表5 黑果腺肋花楸提取物中花色苷組成鑒定Table5 Identif i cation of anthocyanins in A. melanocarpa extracts

根據(jù)圖11～14和表5可知，黑果腺肋花楸提取物中含有6 種花色苷，并且都為矢車菊類（m/z 287）花色苷。由圖12可知，峰1物質(zhì)分子離子m/z 897，其碎片離子m/z 735和m/z 573是由母離子連續(xù)失去一分子己糖得到[M-162]+，m/z 287為矢車菊素的配離子峰，通過(guò)查閱文獻(xiàn)[18]分析可知峰1物質(zhì)為矢車菊-己糖苷二聚體，為首次檢測(cè)出的一種花色苷。由圖13可知，峰2物質(zhì)分子離子m/z 449，其碎片離子m/z 287是由母離子失去一分子己糖得到[M-162]+，根據(jù)保留時(shí)間和文獻(xiàn)[26-28]分析峰2物質(zhì)為矢車菊-3-半乳糖苷，峰面積百分比最大，約為55.29%。同理，峰3～5物質(zhì)為矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-阿拉伯糖苷和矢車菊-3-木糖苷。圖14中物質(zhì)分子離子m/z 611，其碎片離子m/z 449和m/z 287是由母離子連續(xù)失去一分子己糖得到[M-162]+，參考文獻(xiàn)[18]可得該物質(zhì)為矢車菊-3,5-二己糖苷，在液相色譜圖中并沒(méi)有找到對(duì)應(yīng)的峰，但在質(zhì)譜條件下被檢測(cè)到，猜測(cè)可能是由于矢車菊-3,5-二己糖苷在黑果腺肋花楸中含量極少，在一般液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)中沒(méi)有出峰。由于生長(zhǎng)環(huán)境與品種的不同，與Wangensteen等[13]研究結(jié)果中黑果腺肋花楸提取物4 種花色苷組成比例略有差異，組成成分增加了2 種含量極少的花色苷。

圖12 矢車菊-3-己糖苷二聚體的一級(jí)（A）、二級(jí)（B）質(zhì)譜圖（峰1）Fig.12 Mass (A) and tandem mass (B) spectra of dimer of cyanidinhexoside (peak 1)

圖13 矢車菊-3-半乳糖苷的一級(jí)（A）、二級(jí)（B）質(zhì)譜圖（峰2）Fig.13 Mass (A) and tandem mass (B) spectra of cyanidin-3-galactoside (peak 2)

圖14 矢車菊-3,5-二己糖苷的一級(jí)（A）、二級(jí)（B）質(zhì)譜圖Fig.14 Mass (A) and tandem mass (B) spectra of cyanidin-3,5-dihexoside

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)影響黑果腺肋花楸花色苷提取效果的提取溫度、超聲功率、料液比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH值進(jìn)行單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定黑果腺肋花楸花色苷的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)64%、pH 2.0、料液比1∶30（g/mL）、超聲溫度60 ℃，超聲功率100 W、超聲時(shí)間31 min，在該條件下黑果腺肋花楸中的花色苷含量可達(dá)（3.61±0.01）mg/g，相比Slimestad[29]和Wangensteen[13]等分別采用的80%甲醇溶液的溶劑提取法和80%乙醇溶液的回流提取法提取的花色苷，含量都有所提高。得到的提取物進(jìn)一步經(jīng)過(guò)XAD-7樹脂純化后，凍干粉中多酚含量為655.107 mg/g，花色苷含量為195 mg/g，占多酚含量的30.53%，起著主要的抗氧化作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，黑果腺肋花楸花色苷提取物有清除DPPH自由基、ABTS+·能力和FRAP活性，均顯著高于VC，在花色苷質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到99.09%，清除ABTS+·能力和FRAP值分別相當(dāng)于2 倍和4 倍的VC，與藍(lán)靛果清除DPPH自由基[30-31]和ABTS+·[18]能力相比，黑果腺肋花楸花色苷提取物的抗氧化能力較強(qiáng)。通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出6 種花色苷，矢車菊-3-半乳糖苷含量最高，其次為矢車菊-3-阿拉伯糖苷。其他2 種新鑒定出來(lái)的花色苷可能為矢車菊-己糖苷二聚體和矢車菊-3,5-二己糖苷。矢車菊-3,5-二己糖苷并未在色譜圖中找到對(duì)應(yīng)的峰，可能是含量比較低，在樣品濃度較大或使用非常靈敏的儀器時(shí)才能檢測(cè)出來(lái)。綜上所述，黑果腺肋花楸花色苷種類比較單一，都屬矢車菊家族花色苷，更有利于分離出單體，而且抗氧化性是VC的2～4 倍。

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