拮抗碭山梨炭疽菌的內生菌篩選及抑菌效果分析

郭志華，段騰飛，江翠翠，王 芳

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000）

植物內生菌是指在其生活史的一定階段或全部階段，生活于健康植物各種組織和器官的細胞間隙或細胞內，不引起植物組織明顯癥狀改變的微生物[1-3]。2008年，碭山酥梨產區暴發梨炭疽病，病果率達到70%以上，僅安徽省碭山縣梨農直接經濟損失超過7億 元[4]。炭疽菌主要侵害果實和葉片，導致果實整體腐爛，果皮變黑色[5]。現在對炭疽菌的有效防治主要是化學農藥[6]，長期使用化學農藥易使病菌產生耐藥性，并且化學農藥污染環境，可通過環境食物鏈進入人體，嚴重危害人體健康[7]。內生細菌存在于植物體內，生存環境穩定，可經受住植物自身的防衛反應，與病菌直接相互作用[8]。

國內外科研人員已經分離篩選一些重要的生防微生物。柳鳳等[9]從紅樹林體內分離的內生菌AiL3，對芒果炭疽菌抑菌效果較好。李春玲等[10]從芒果表皮分離得到29株內生細菌，對峙培養法發現菌株B2-1對芒果炭疽菌菌絲的生長具有較強抑制作用。石晶盈等[11]從番木瓜果皮內篩選具有較強拮抗活性的內生細菌防治番木瓜采后炭疽病和疫霉病，以減少果實采后病害帶來的損失。袁紅旭等[12]從不同品種柑橘果實中分離出16 株內生細菌，研究篩選出4 株對柑橘炭疽病有較好防治作用、具有應用前景的拮抗內生細菌。具有較好拮抗植物病原微生物的內生細菌種類中芽孢桿菌較多，芽孢桿菌能產生強效抑菌物質，具有培養要求簡單、繁殖速度快等優點[13]。美國迄今已有3 株枯草芽孢桿菌和1 株解淀粉芽孢桿菌獲得商品化生產許可[14]。關于芽孢桿菌生防機制主要包括營養和空間位點競爭、分泌抗菌物質、溶菌作用，誘導植物抗病性等方面[15-16]，其中分泌抗菌物質研究的較多，芽孢桿菌分泌的抗菌物質包括抗菌蛋白和抗菌脂肽類物質[17-18]。

本研究以安徽特產碭山梨為研究對象，從健康碭山梨中分離篩選拮抗碭山梨炭疽菌的內生菌，通過形態特征觀察、理化性質測試和16S rDNA鑒定菌株。檢測發酵液抑菌性，研究發酵蛋白粗提液性質和內生菌對感染炭疽菌的碭山梨果實防御酶活性的影響，初步研究碭山梨內生菌拮抗炭疽菌的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碭山梨采自宿州碭山良梨鎮果園；碭山梨膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）為實驗室保存。

PDA培養基（培養真菌）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水 1 000 mL、自然pH值。牛肉膏蛋白胨培養基（培養細菌）：牛肉膏5.0 g 、蛋白胨10.0 g、NaCl 5 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2～7.4。

DNA提取試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、膠回收試劑盒、蛋白酶K美國Sigma公司；其余均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AL204分析天平 上海天平儀器技術公司；BBS-SDC-A超凈工作臺 博科生物公司；MyCycler PCR擴增儀 美國Bio-Rad公司；SHP-250型生化培養箱上海精宏公司。

1.3 方法

1.3.1 碭山梨內生菌的分離

從碭山果園采收無病蟲害、成熟度較好的碭山梨。取約0.5 g果肉放到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃振蕩培養18～24 h；取200 μL培養液涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養基，37 ℃靜置培養18～24 h；用無菌牙簽蘸取單菌落轉接入牛肉膏蛋白胨液體培養基中37 ℃振蕩培養18～24 h，平板劃線純化后保存。

1.3.2 內生菌對碭山梨膠孢炭疽菌菌絲生長的抑制作用

將碭山梨膠孢炭疽菌在PDA平板上活化待用；將內生菌分別置于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃振蕩培養18～24 h，使菌液濃度為104～105CFU/mL待用。

平板對峙培養法：用打孔器（d=6 mm）在活化好的碭山梨膠孢炭疽菌的菌落邊緣打取菌絲塊，將菌絲塊挑入PDA平板中心，培養48 h后，在培養皿的上下左右距離菌絲塊2 cm處各放置1 片無菌濾紙圓片，在每個濾紙片上注入20 μL的內生菌菌液。接種后的培養皿置于28 ℃培養，每個處理重復3 次，以濾紙片上注入無菌水作為對照。5 d后對平板抑制情況進行拍照處理并按下式計算菌絲生長抑制率[18-19]。

1.3.3 內生菌DSL-9的鑒定

觀察DSL-9單菌落形狀、顏色、表面等培養特征；革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形狀、排列方式等形態特征。DSL-9菌株進行甲基紅、接觸酶、明膠液化、淀粉水解、產吲哚、硝酸鹽還原、糖發酵等實驗[20-21]。以細菌16S rDNA通用引物為上下游引物，染色體DNA為模板擴增DSL-9菌株的16S rDNA[22]。PCR產物由上海生物工程有限公司測序，所得16S rDNA序列通過NCBI網站BLAST進行核酸數據比對。

1.3.4 DSL-9發酵液對碭山梨膠孢炭疽菌拮抗作用

內生菌DSL-9培養至菌液濃度為105～106CFU/mL，制備待測液分別為：發酵菌液離心后取上清液，用濾膜過濾得無菌體濾液；發酵液經121 ℃、15 min處理；無菌水。待測液均勻涂布在牛肉膏蛋白胨培養基，將碭山梨膠孢炭疽菌菌絲塊置于平板中央。

1.3.5 內生菌DSL-9蛋白粗提物制備

內生菌DSL-9培養液離心后取無菌上清液，上清液用(NH4)2SO4飽和溶液鹽析，4 ℃沉淀過夜，離心30 min，棄去上清液，以pH 7.2磷酸緩沖液溶解沉淀，4 ℃透析過夜，透析液12 000 r/min離心20 min，上清液0.22 μm濾膜過濾，為蛋白粗提液，4 ℃保存備用[14]。

蛋白粗提液分別置于20、30、40、50、60、70、80 ℃水浴鍋中水浴1 h，90、100、110、120 ℃油浴1 h且冷凝回流，按1.3.2節方法計算抑菌率。

用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調蛋白粗提液pH值為4、5、6、7、8、9、10七個梯度，同時保證蛋白濃度不發生改變， 4 ℃過夜，按1.3.2節方法計算抑菌率。

將蛋白粗提液置于25 W紫外燈下10 cm處照射2、4、6、8、10 h，按1.3.2節方法計算抑菌率。

蛋白粗提液中加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和蛋白酶K，終質量濃度為1 mg/mL，37 ℃水浴1 h，80 ℃水浴處理30 min使蛋白酶變性，按1.3.2節方法計算抑菌率。

1.3.7 內生菌DSL-9對染病果實生理生化的影響

主成分分析圖可以直觀地反映出各樣品的相對位置及與感官特征的相關關系，樣品之間、樣品與感官特征之間的相對位置越近，表明它們在風味特征上，關系越密切[27]，16種怪味胡豆樣品與風味特征在F1/F2坐標中的分布，見圖1。

選取健康碭山梨果實，75%乙醇溶液表面消毒，表面噴炭疽菌培養液，以果實表面布滿為準，果面晾干后再噴內生菌培養液，以果實表面布滿為準，25 ℃恒溫培養箱中培養。接種后1、2、3、4、5、6、7 d分別測量可溶性蛋白含量和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性[15]。

1.4 數據分析

所有的實驗均做3 次平行，實驗數據采用Excel軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 碭山梨內生菌的分離

從碭山梨中共分離純化15 株內生菌，分別命名為DSL-1、DSL-2、DSL-3、DSL-4……DSL-15。其中經革蘭氏染色6 株為革蘭氏陰性菌，9 株為革蘭氏陽性菌。

2.2 拮抗碭山梨炭疽菌的內生菌的篩選

15 株內生菌對碭山梨膠孢炭疽菌抑菌率分別為34%、25%、2%、3%、0%、18%、10%、30%、56%、12%、21%、16%、0%、11%、20%。其中內生菌DSL-9的抑菌率為56%，抑菌效果最好。從圖1A可知，未轉接內生菌DSL-9的平板中，碭山梨膠孢炭疽菌菌絲生長正常，菌落呈圓形擴展。圖1B中接種內生菌DSL-9，內生菌DSL-9對炭疽菌的菌絲生長產生明顯的抑制作用，形成十字形，這可能是因為DSL-9分泌的代謝物對炭疽菌的菌絲生長產生抑制作用。

圖1 內生菌DSL-9抑制碭山梨炭疽菌菌絲生長的菌落圖Fig.1 DSL-9 inhibited the mycelial growth of C. gloeosporioides

2.3 內生菌DSL-9的鑒定

2.3.1 形態特征觀察

DSL-9革蘭氏染色為陽性，顯微鏡觀察DSL-9菌體為桿狀，菌體中央有橢圓狀芽孢，平板觀察菌落微黃色，表面干燥粗糙。

2.3.2 生理生化特征鑒定

DSL-9菌株甲基紅實驗陽性、硝酸鹽還原實驗陽性、葡萄糖培養產酸不產氣、不發酵乳糖、可液化明膠、水解淀粉、不產吲哚。

2.3.3 16S rDNA 的擴增和序列分析

以DSL-9菌株的DNA為模板，PCR擴增得大小約為1.5 kb的基因片段。采用BLAST與GenBank中已登錄的基因序列進行比對，結果發現DSL-9的16S rDNA與枯草芽孢桿菌同源性為98%。根據形態特征觀察、生理生化特征鑒定和16S rDNA的序列分析，DSL-9初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[20-21]。

2.4 DSL-9發酵液對碭山梨膠孢炭疽菌拮抗作用

圖2 不同處理DSL-9培養液對碭山梨膠孢炭疽菌拮抗作用Fig.2 Effect of different treatments on inhibitory activity of the culture broth of DSL-9 against C. gloeosporioides

如圖2所示，發酵液經3 種方式處理后，內生菌DSL-9發酵液和離心后上清液經過濾后的無菌體發酵液幾乎抑制炭疽菌的生長，說明內生菌DSL-9對炭疽菌生長有較強的抑菌效果，抑菌物質可能是DSL-9菌株分泌到胞外的代謝產物；圖2C和圖2D可觀察到完整的炭疽菌菌落，菌絲生長正常，說明經121 ℃、20 min處理后的發酵液和無菌水均無抑菌活性，121 ℃高溫可使發酵液中抑菌物質失活。

2.5 內生菌DSL-9蛋白粗提液性質分析

2.5.1 溫度對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響

圖3 溫度對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of temperature on inhibitory activity of the antifungal substance from strain DSL-9

內生菌DSL-9蛋白粗提液具有較好的熱穩定性，如圖3所示，30～60 ℃水浴1 h抑菌率變化不大。隨著處理溫度逐漸升高，抑菌率逐漸下降。100 ℃熱處理1 h，抑菌率是30 ℃的60%左右，在120 ℃熱處理1 h，抑菌活性幾乎喪失。

2.5.2 pH值對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響

圖4 pH值對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響Fig.4 Effect of pH on inhibitory activity of the antifungal substance from strain DSL-9

從圖4可看出，蛋白粗提液在pH值在4～5區間抑菌率較低，在pH值為4時只有pH值為7時抑菌活性的58%。pH值為7時抑菌活性最高，pH值在7～10區間抑菌活性無明顯變化，抑菌物質在堿性環境有活性。

2.5.3 紫外線對DSL-9蛋白粗提液活性的影響

DSL-9蛋白粗提液經25 W紫外燈照射后，抑菌率如圖5所示，基本無變化，表明DSL-9抗菌物質對紫外線不敏感，具有一定的抗紫外線功能。

圖5 紫外線對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響Fig.5 Effect of UV light on inhibitory activity of the antifungal substance from strain DSL-9

2.5.4 蛋白酶對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響

在用不同的蛋白酶對內生菌進行處理后，抑菌率的變化如圖6所示，經不同蛋白酶處理后，抑菌率下降幅度較大（P＜0.01），仍有部分抑菌率，說明DSL-9抑菌物質可能部分是蛋白質，部分是其他物質。

圖6 蛋白酶對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響Fig.6 Effect of proteases on inhibitory activity of the antifungal substance from strain DSL-9

2.6 內生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨的防御酶的影響

2.6.1 內生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨PPO的影響

圖7 內生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨PPO的影響Fig.7 Effect of DSL-9 on PPO of Dangshan pear infected with anthrax

由圖7可看出，腐敗菌對碭山梨的侵染短時間內PPO活性是增高的，但隨著侵染時間的延長，3 d后活性顯著降低。可能是因為炭疽菌對果實侵染后，PPO迅速感應，活性顯著升高，對植物組織起到一定的保護作用，但隨著侵染時間的延長，PPO活性下降。處理組的PPO活性高峰出現在第4天，比病菌組推遲，且PPO最大活性低于病菌組。

2.6.2 內生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨SOD的影響

圖8 內生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨SOD的影響Fig.8 Effect of DSL-9 on SOD of Dangshan pear infected with anthrax

從圖8可看出，病菌組的SOD活性在第3天達到最大值，病菌的侵染屬于生理性脅迫，可導致果肉組織產生大量活性氧和自由基，SOD的產生可保護植物細胞免受損傷。處理組的SOD活性變化和對照組的趨勢一致，先上升后下降，這說明內生菌DSL-9能減輕病菌對梨果實的侵染。

2.6.3 內生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨POD影響

圖9 內生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨POD的影響Fig.9 Effect of DSL-9 on POD of Dangshan pear infected with anthrax

由圖9可看出，病菌組和處理組POD活性變化趨勢一致，先上升后下降，在第4天達到活性高峰，但是處理組的POD活性高峰大于病菌組，說明內生菌可能有誘導POD活性升高的作用。

2.6.4 內生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨CAT的影響

圖10 內生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨CAT的影響Fig.10 Effect of DSL-9 on CAT of Dangshan pear infected with anthrax

由圖10可看出，內生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨CAT的影響的趨勢和其他防御酶相似，都是先上升后下降，CAT活性高峰出現在第3天，處理組CAT活性高于病菌組，說明內生菌可誘導CAT活性，提高碭山梨的抗性。

3 討 論

近幾年，碭山梨感染炭疽菌，導致產量急劇下降，使用化學農藥作為殺菌劑易污染環境，危害人體健康。內生菌可作為生物防治菌，本實驗從健康碭山梨中分離出15 株內生菌，采用平板對峙培養法篩選出1 株對碭山梨膠孢炭疽菌抑菌活性較高的菌株，命名為DSL-9，采用形態特征和16S rDNA，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。據文獻報道，枯草芽孢桿菌能夠拮抗超過30 種的植物病原菌，是目前生物防治和水果保鮮中研究最多的一種有益微生物[23]。DSL-9發酵液經處理后發現無菌體發酵液具有較好抑菌活性，說明DSL-9菌株對炭疽菌的抑制作用主要是通過胞外分泌物作用的結果，這與先前報道一致[24]。

采用硫酸銨沉淀法獲得DSL-9的粗蛋白提取液，蛋白提取液在30～60 ℃抑菌率無明顯變化，高于60 ℃抑菌率下降，說明抑菌物質熱穩定性較好。在pH 7～10區間抑菌活性較高，且無明顯變化，說明抑菌物質在堿性環境具有較好的抑菌活性。紫外線對抑菌物質無明顯影響。蛋白提取液經蛋白酶處理后，抑菌活性下降，但仍有部分抑菌活性，說明抑菌物質含有蛋白質，還可能含有其他物質，現已報道的枯草芽孢桿菌能產生的抗菌物質有肽類、環脂肽類、多烯類等[21]。枯草芽孢桿菌產生的脂肽類抗菌物質對蛋白酶具有穩定性；蛋白類抗菌物質熱穩定性較差，易被蛋白酶分解[25-29]，DSL-9產生的抗菌物質既有脂肽類抗菌物質也有蛋白抗菌物質。

PPO、POD、SOD和CAT共同組成了生物體內活性氧防御系統，在清除超氧陰離子自由基、H2O2和過氧化物以及組織或減少羥自由基形成等方面發揮重要作用。接種病原菌后果實中的防御酶活性均顯著高于對照，且在觀察期內出現活性高峰，說明果實在逆境條件下能最大限度的被激發產生防御酶活性，暫時減輕病害侵染造成的傷害，處理組的活性高峰低于病菌組，說明處理組的病害比病菌組要輕。侵染后期這些酶的活性均受到抑制作用，細胞內活性氧積累過多，造成膜脂過氧化，破壞質膜通透性，損壞細胞。病菌組在后期防御酶活性均低于對照組和處理組。

綜上可知內生菌DSL-9可以抑制炭疽菌的生長并可能誘導果實產生抗性，內生菌DSL-9拮抗炭疽菌具體機制有待于進一步研究。

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