徐曉東,宋 澤,馮 濤,宋詩(shī)清*,孫 敏,姚凌云
(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418)
草菇又名蘭花菇、苞腳菇,是一種重要的熱帶亞熱帶菇類(lèi)。目前,全球栽培最多的6 種食用菌里就有草菇[1]。我國(guó)草菇產(chǎn)量占全世界總產(chǎn)量的70%~80%,居世界之首[2]。2013年我國(guó)草菇產(chǎn)量為31.1萬(wàn) t,2014年產(chǎn)量為33.5萬(wàn) t,占同期國(guó)內(nèi)食用菌總產(chǎn)量的1.1%。草菇營(yíng)養(yǎng)豐富,味道鮮美,富含蛋白質(zhì)和多種氨基酸,其中必需氨基酸含量占40.47%~44.47%[3]。組成食用菌蛋白的氨基酸中含有高比例的谷氨酰胺和谷氨酸,一級(jí)結(jié)構(gòu)中富含鮮味肽序列,是生產(chǎn)高品質(zhì)呈味基料的優(yōu)質(zhì)原料[4]。
食用菌的滋味是由豐富多樣的風(fēng)味物質(zhì)引起的,主要分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性?xún)深?lèi)。非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要是一些可溶性糖及糖醇、有機(jī)酸、游離氨基酸以及5’-核苷酸等[5-6]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)草菇等食用菌的研究主要集中在多糖、貯藏保鮮及初級(jí)調(diào)味品開(kāi)發(fā)等研究方面,例如研究不同方法提取草菇多糖體外抗氧化活性[7]、草菇多糖的分離純化和生物活性[8]、草菇貯藏過(guò)程中抗氧化酶活力的變化[9]、分析食用菌中的呈味物質(zhì)及鮮味評(píng)價(jià)[10-11],但研究不同提取方法對(duì)草菇呈味物質(zhì)釋放的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以可溶性糖及糖醇、有機(jī)酸、5’-核苷酸、游離氨基酸組成和含量、分子質(zhì)量分布為指標(biāo),研究常壓蒸煮、高壓蒸煮以及酶解處理3 種預(yù)處理方法對(duì)草菇呈味物質(zhì)釋放的影響,為食用菌調(diào)味料的開(kāi)發(fā)及風(fēng)味增強(qiáng)肽產(chǎn)品的研究提供理論依據(jù)。
草菇成熟子實(shí)體采自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗(yàn)基地。
纖維素酶(20 000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(20 000 U/g)、食用菌水解酶(2 000 U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司;海藻糖、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、甘露醇、5’-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)Sigma公司;氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 日本W(wǎng)ako公司;其他試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
ICS2500型離子色譜儀、Carbo Pac PA-20陰離子交換分析柱、Carbo Pac MA-1陰離子交換柱 美國(guó)Dionex公司;600高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司;Ultimate AQ-C18色譜柱 上海月旭材料科技有限公司;Green ODS-AQ C18色譜柱 上海易創(chuàng)儀器分析有限公司;ATN-300全自動(dòng)凱氏定氮儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;754PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DHG-9145A型鼓風(fēng)干燥箱 HWS28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;BF00A粉碎機(jī) 上海淀久機(jī)械制造有限公司;Milli-Q超純水設(shè)備 美國(guó)Ultra公司。
1.3.1 原料前處理
所采集的草菇用流動(dòng)自來(lái)水沖洗后,一部分用于測(cè)定水分含量,另一部分用粉碎機(jī)打磨成勻漿,-18 ℃冷凍備用。
1.3.2 草菇樣品的不同處理
1.3.2.1 草菇酶解液的制備
稱(chēng)取100 g勻漿樣品,按料液比1∶40(g/mL)加入去離子水,在pH 3.5、溫度45 ℃條件下,加入纖維素酶0.5 g,酶解1.5 h;然后調(diào)節(jié)pH值為6.0,溫度為50 ℃,加入風(fēng)味蛋白酶0.4 g,繼續(xù)酶解1.5 h,升溫至90 ℃滅酶5 min后,7 000 r/min冷凍離心15 min,取上清液備用。
1.3.2.2 草菇常壓蒸煮液的制備
稱(chēng)取100 g勻漿樣品,按料液比1∶1.5(g/mL)加入去離子水,100 ℃蒸煮2 h,蒸煮液冷卻后,7 000 r/min冷凍離心15 min,取上清液備用。
1.3.2.3 草菇高壓蒸煮液的制備
稱(chēng)取100 g勻漿樣品,按料液比1∶1.5(g/mL)加入去離子水,在40 kPa壓力下蒸煮1.5 h,蒸煮液冷卻后,7 000 r/min冷凍離心15 min,取上清液備用。
1.3.3 指標(biāo)的測(cè)定
1.3.3.1 新鮮草菇中的水分、總糖、粗蛋白、粗脂肪含量測(cè)定
對(duì)洗凈的鮮菇的水分、總糖、粗蛋白和粗脂肪含量進(jìn)行檢測(cè)。水分含量的檢測(cè)采用烘箱法,參照文獻(xiàn)[12]。總糖的檢測(cè)采用苯酚-硫酸法,參照文獻(xiàn)[13]。粗蛋白的檢測(cè)采用凱氏定氮法,參照文獻(xiàn)[14]。粗脂肪含量測(cè)定采用酸水解法,參照文獻(xiàn)[15]。
1.3.3.2 可溶性糖測(cè)定
可溶性糖的提取參考Ajlouni等[16]的方法。分別稱(chēng)取1 g制備樣,加入50 mL 80%乙醇溶液,搖勻后于30 ℃搖床振搖45 min,抽濾。將濾渣用80%乙醇溶液沖洗3 次,取濾液于55 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇,超純水定容至10 mL。將樣品12 000 r/min離心10 min后進(jìn)行稀釋?zhuān)锨逡哼^(guò)0.22 μm混合纖維素酯(mixed cellulose ester,MCE)微孔濾膜上機(jī)測(cè)試。
可溶性糖含量的測(cè)定:?jiǎn)翁牵篊arbo Pac PA-20陰離子交換分析柱(150 mm×3 mm);柱溫30 ℃;流動(dòng)相為純水和0.25 mol/L NaOH溶液,流速為0.45 mL/min,進(jìn)樣量25 μL;可溶性糖醇:Carbo Pac MA-1陰離子交換柱(4 mm×250 mm);柱溫30 ℃;流動(dòng)相為0.48 mol/L NaOH溶液,流速為0.4 mL/min,進(jìn)樣量25 μL。
1.3.3.3 有機(jī)酸測(cè)定
分別稱(chēng)取1 g制備樣,加入50 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液,60 ℃振搖60 min提取有機(jī)酸。待冷卻后將提取液12 000 r/min離心15 min,上清液過(guò)0.22 μm MCE微孔濾膜用高效液相色譜儀檢測(cè)。色譜條件:Green ODS-AQ C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為10 mmol/L KH2PO4緩沖鹽溶液,pH 2.8,流速1.0 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量5 μL。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間及峰面積建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中相應(yīng)物質(zhì)的含量。
1.3.3.4 游離氨基酸測(cè)定
采用OPA FMOC柱前衍生化法測(cè)定[17]。色譜條件:ODS HYPERSIL色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫40 ℃;流速1 mL/min。流動(dòng)相:A相:8.0 g乙酸鈉溶于1 000 mL水中,再加入225 μL三乙胺,攪拌并滴加5%的醋酸溶液,將pH值調(diào)至7.2,加入5 mL四氫呋喃,混合后備用。B相:8.0 g乙酸鈉溶于400 mL水中,滴加2%醋酸溶液將pH值調(diào)至7.2,將此溶液加入800 mL乙腈和800 mL甲醇,混合后備用。洗脫程序:0~17.0 min,B相0%~60%;17.0~18.0 min,B相60%~100%;18~23 min,B相100%。
1.3.3.5 5’-核苷酸測(cè)定
5’-核苷酸的提取參考Taylor等[18]方法。分別稱(chēng)取1 g制備樣,加入25 mL蒸餾水,煮沸1 min,冷卻至室溫后于12 000 r/min離心15 min,取出上清液,廢渣以相同方法重提一次,合并上清液,定容至50 mL。取定容后的上清液過(guò)0.22 μm MCE微孔濾膜,由高效液相色譜儀進(jìn)行5’-核苷酸含量的檢測(cè)。色譜條件:Ultimate AQ-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相10 mmol/L KH2PO4緩沖液(pH 4.68),檢測(cè)波長(zhǎng)259 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量5 μL。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間及峰面積建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中相應(yīng)物質(zhì)的含量。
1.3.3.6 分子質(zhì)量的分布測(cè)定
采用高效液相色譜法。色譜條件:TSKgel 2000 SWXL色譜柱(300 mm×7.8 mm);流動(dòng)相:乙腈-水-三氟乙酸體積比45∶55∶0.1;柱溫30 ℃;流速0.5 mL/min。
所有實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣品做3 次平行,數(shù)值以 ±s表示,由SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性分析,分析方法為最小顯著極差法(least significant rang,LSR),顯著性水平為P<0.05。
新鮮草菇的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)82.4%,總糖、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為35.1%、1.24%、24.3%。食用菌中小分子可溶性糖及糖醇是其甜味的主要來(lái)源[19],但并不是食用菌特有的風(fēng)味。由表1可知,草菇中含量最高的是海藻糖,占可溶性糖總量的50%以上。海藻糖是食用菌中的一種特有的糖,是一種低致齲性甜味劑[20],因?yàn)槠錅睾偷奶鸲取⒎€(wěn)定的性能及良好的保濕效果,海藻糖近些年來(lái)常被用于食品或飲料中[21]。甘露醇是唯一能檢測(cè)到的糖醇,是草菇的主要糖醇類(lèi)物質(zhì),其能量是糖的一半,由于其不容易被人體吸收,因此不會(huì)像糖一樣增加太多胰島素水平,也不易引起蛀牙[22]。

表1 草菇原液及不同制備液的可溶性糖及糖醇含量Table1 Contents of soluble sugar and sugar alcohol of mushroom homogenate before and after different treatments
和原液相比,常壓蒸煮制備液可溶性糖的總量顯著降低,主要原因可能是還原糖參與美拉德反應(yīng)導(dǎo)致的;高壓蒸煮制備液可溶性糖的總量和草菇原液基本相同,雖然高壓蒸煮過(guò)程中也伴隨有美拉德反應(yīng),但高壓使得細(xì)胞破壞程度更大,釋放了某些糖類(lèi),推測(cè)糖的釋放量和參與反應(yīng)的量相當(dāng),導(dǎo)致可溶性糖的總量基本不變,其中海藻糖、阿拉伯糖和甘露糖的含量明顯增加,巖藻糖、鼠李糖及葡萄糖含量顯著降低。和原液相比,由纖維素酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解作用極顯著地提高了可溶性糖的總量,主要表現(xiàn)為葡萄糖含量的明顯增加,原因可能是由于纖維素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纖維素生成葡萄糖的一種酶,所以導(dǎo)致酶解物中葡萄糖含量顯著增加。

表2 草菇原液及不同制備液的有機(jī)酸含量Table2 Content of organic acids of mushroom homogenate before and after different treatments
如表2所示,和原液相比,常壓蒸煮制備液有機(jī)酸總量顯著增加,特別是乙酸和丁二酸。乙酸具有特殊味道,能對(duì)人的舌后部產(chǎn)生較強(qiáng)的刺激[23],丁二酸鈉鹽是鮮味的主要呈味成分。酒石酸和富馬酸的含量稍有增加,酒石酸存在于多種植物中,特別是葡萄中含量很多[24],常用于制造飲料;富馬酸具有類(lèi)似水果味,可作為酸味劑,用于清涼飲料、水果糖、果凍、冰淇淋等,大多與檸檬酸并用。蘋(píng)果酸的含量稍有降低,檸檬酸的含量顯著降低,檸檬酸具有清新的、新鮮的酸味,但這種味道和蘋(píng)果酸不同。
和原液相比,高壓蒸煮制備液有機(jī)酸總量增加顯著,其中乙酸和丁二酸含量也顯著增加,酒石酸、蘋(píng)果酸和富馬酸的含量稍有增加,檸檬酸的含量顯著降低;同時(shí)高壓蒸煮也檢測(cè)到乳酸的存在。相反,復(fù)合酶解制備液有機(jī)酸總量顯著降低,其原因是蘋(píng)果酸和檸檬酸的含量顯著降低所致。無(wú)論蒸煮還是酶解,都對(duì)草菇組織中有機(jī)酸的釋放有促進(jìn)作用,對(duì)于含量降低的有機(jī)酸其原因可能是參與了化學(xué)反應(yīng)所致。

表3 草菇原液及不同制備液的游離氨基酸及5’-核苷酸含量Table3 Contents of free amino acids and 5’-nucleotides of mushroom homogenate before and after different treatments
游離氨基酸是食用菌中重要的鮮味活性物質(zhì)。由表3可知,常壓蒸煮、高壓蒸煮和復(fù)合酶解作用后的游離氨基酸總量均有所增加。3 種處理方法相比,蒸煮獲得的游離氨基酸更多,尤其是高壓蒸煮,其主要原因是高溫高壓對(duì)植物細(xì)胞壁的降解作用更劇烈,使更多的游離氨基酸釋放出來(lái)。其中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸的含量在經(jīng)過(guò)不同處理之后都有所增加,以高壓蒸煮制備液增加的最顯著。天冬氨酸和谷氨酸是草菇中主要的呈鮮物質(zhì),亮氨酸和脯氨酸是參與美拉德反應(yīng)、產(chǎn)生呈味物質(zhì)的重要前體物[25]。
根據(jù)氨基酸的呈味特性,將其分為鮮味、甜味、苦味以及無(wú)味4 種,鮮味氨基酸:天冬氨酸+谷氨酸;甜味氨基酸:蘇氨酸+絲氨酸+甘氨酸+丙氨酸+脯氨酸;苦味氨基酸:纈氨酸+甲硫氨酸+異亮氨酸+亮氨酸+苯丙氨酸+組氨酸+精氨酸;無(wú)味氨基酸:半胱氨酸+酪氨酸+賴(lài)氨酸,分別計(jì)算其含量,結(jié)果如表4所示。

表4 游離氨基酸分類(lèi)及含量Table4 Types and contents of free amino acids in mushroom homogenate before and after different treatments
谷氨酸與食鹽結(jié)合形成L-谷氨酸鈉是鮮味的代表物質(zhì),也是味精的主要成分,雖然天冬氨酸鈉鹽的鮮味程度低于L-谷氨酸鈉的10%[26],但是仍具有明顯的鮮味,通常把天冬氨酸和谷氨酸均歸類(lèi)為鮮味氨基酸,由表4可知,二者總量約占游離氨基酸總量的20%。丙氨酸是重要的甜味氨基酸,與谷氨酸等鮮味物質(zhì)相互作用具有提鮮效果[27],常壓蒸煮、高壓蒸煮和復(fù)合酶分步作用后的丙氨酸含量都有所增加,其中以高壓蒸煮最為明顯。高壓蒸煮制備液的鮮味氨基酸、甜味氨基酸以及苦味氨基酸的含量都增加的最顯著。
草菇中只檢測(cè)出5’-鳥(niǎo)苷酸,是對(duì)鮮味有貢獻(xiàn)的呈味核苷酸,5’-鳥(niǎo)苷酸與L-谷氨酸鈉有強(qiáng)烈的增鮮協(xié)同作用,其增鮮程度最高可達(dá)到單獨(dú)使用L-谷氨酸鈉的30 倍[28]。2 種蒸煮處理均使5’-鳥(niǎo)苷酸含量有所增加,高壓蒸煮增加的更明顯,而酶解處理顯著降低了呈味核苷酸的含量,這可能是由于酶解使得部分核苷酸受到破壞。

表5 草菇原液及不同制備液的肽分子質(zhì)量分布Table5 Molecular mass distribution of peptides in mushroom homogenate before and after different treatments
由表5可以明顯看出,不同提取方法得到的制備液中肽的分子質(zhì)量分布明顯不同。和原液相比,常壓蒸煮、高壓蒸煮和酶解作用后,小于500 Da組分的含量都有增加,高壓蒸煮制備液增加的最顯著,這是因?yàn)楦邷馗邏旱臈l件使得大分子分解成小分子的程度大。
氨基酸的分子質(zhì)量一般都小于500 Da,即3 種不同提取方法處理后,氨基酸的含量都有所增加,以高壓蒸煮的增加最為明顯,這與游離氨基酸的分析結(jié)果一致。另外,食用菌味道鮮美是源于其含有許多鮮味物質(zhì),呈味肽就是一類(lèi)重要的風(fēng)味物質(zhì),呈味肽是一類(lèi)分子質(zhì)量小于3 000 Da的寡肽[29],這類(lèi)肽組分可與舌頭味蕾上某一味道的特異性受體相互作用,呈現(xiàn)特征滋味[30]。由表5可以看出,高壓蒸煮制備液中,小于3 000 Da的組分含量最多,因此,通過(guò)高壓蒸煮獲得呈味肽是有效途徑之一。
經(jīng)過(guò)常壓蒸煮、高壓蒸煮、復(fù)合酶解3 種不同提取方法獲得的制備液,呈味物質(zhì)都有一定的變化,3 種不同的提取方法對(duì)草菇呈味物質(zhì)釋放的影響不盡相同。和原液相比,常壓蒸煮制備液可溶性糖的總量顯著降低,這可能是還原糖參與美拉德反應(yīng)導(dǎo)致的;高壓蒸煮制備液可溶性糖的總量和草菇原液基本相同;而由纖維素酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解作用顯著地提高了可溶性糖的總量,主要表現(xiàn)為葡萄糖含量的明顯增加。從有機(jī)酸的變化來(lái)看,和原液相比,常壓及高壓蒸煮制備液有機(jī)酸總量顯著增加,尤其是高壓蒸煮;而復(fù)合酶解制備液有機(jī)酸含量顯著降低,主要是由其蘋(píng)果酸和檸檬酸的含量顯著降低所致。從游離氨基酸總量上看,不同方法處理后的游離氨基酸總量都有所增加。3 種處理方法相比,蒸煮獲得的游離氨基酸更多,尤其是高壓蒸煮,這主要是因?yàn)楦邷馗邏簩?duì)植物細(xì)胞壁的降解作用更劇烈,使更多的游離氨基酸釋放出來(lái)。其中高壓蒸煮制備液的鮮味氨基酸、甜味氨基酸以及苦味氨基酸的含量都增加的最為顯著。草菇中只檢測(cè)出5’-鳥(niǎo)苷酸對(duì)鮮味有貢獻(xiàn)的呈味核苷酸,2 種蒸煮處理都使5’-鳥(niǎo)苷酸含量有所增加,高壓蒸煮增加的更明顯,而酶解處理顯著降低了呈味核苷酸的含量。不同提取方法得到的制備液中肽的分子質(zhì)量分布明顯不同。和原液相比,常壓蒸煮、高壓蒸煮和酶解作用后,小于500 Da組分的含量都有增加,以高壓蒸煮的增加最為明顯。高壓蒸煮制備液中,小于3 000 Da的組分含量最多,是制備呈味肽有效的處理方法之一。
綜上,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同處理方法對(duì)草菇中呈味物質(zhì)釋放的影響,為草菇深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)以及食用菌調(diào)味料的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。
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