惡臭假單胞菌UW4中趨化受體蛋白的克隆、表達及鑒定

李濤

摘 要：植物根際促生菌因其能夠促進植物生長、防治病害的優勢日益受到廣泛關注，其研究主要集中在假單胞菌類，假單胞菌類在植物根際的定殖主要與趨化作用相關。本研究通過生物信息學軟件對惡臭假單胞菌UW4的甲基趨化受體蛋白（MCPs）進行篩選，然后對其進行克隆和表達，結果表明：克隆得到的MCP1可穩定表達，通過對惡臭假單胞菌UW4的甲基趨化受體蛋白的純化及分析其與不同配體物質的熱力學作用強弱，以期找出惡臭假單胞菌特異性的趨化受體，進一步闡明其趨化機理，為惡臭假單胞菌對植物的促生效應提供理論支撐。

關鍵詞：植物根際促生菌；趨化；ACC 脫氨酶；MCP；SDS-PAGE

中圖分類號：Q785 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.05.001

Abstrac： The plant growth-promoting rhizosphere bacteria became more and more striking because it could promote the growth， prevent and treat diseases of plant. These researches mainly concentrated on the Pesudomonas. Pesudomonas colonization in plant rhizosphere was related to chemotaxis. This study screened the methyl chemotaxis receptor proteins （MCPs） of Pesudomonas UW4 by using several bioinformatics software， and then cloned and expressed the MCPs. The result showed that the cloned MCP1 could express stably， through the purification of the methyl chemotaxis receptor proteins of Pseudomonas UW4 and analysis the thermodynamic effect of the different ligands with MCPs， we could find out the specificity chemotaxis receptors of Pesudomonas UW4， clarify its chemotaxis mechanism and give some theoretical supporting to the growth-promoting of plant.

Key words： plant growth-promoting rhizosphere bacteria； chemotaxis； ACC deaminase； methyl chemotaxis receptor protein； SDS-PAGE

綠色農業概念的提出源于我國綠色食品產業約二十年長足發展的豐富實踐。事實證明，綠色農業是符合我國國情、適合現代農業發展新形勢的可持續農業發展形態與模式。農業可持續發展強調逐步減少化肥用量，大力發展農業生物技術產業。植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）因其能夠促進植物生長、防治病害的優勢日益受到廣泛關注[1]，其研究主要集中在假單胞菌類，該類群能夠抑制多種植物病害特別是土傳病害的發生[2]，相關研究內容主要涵蓋有效根部定殖、抗生作用、根圍營養競爭、分泌降解病原微生物的酶等方面。有研究表明，假單胞菌 CHA0 能在鐵素缺乏的條件下自然產生水楊酸（Salicylic acid，SA），同時還可提高煙草（Nicotiana tabacum）對煙草花葉病毒的抵抗能力[3]。假單胞菌屬（Pseudomonas）還可產生氫氰酸抑制病原真菌根串珠霉（ Thielaviopsis basicola） 引起的煙草黑根病；可分解萎蔫酸進而減輕植物受害程度[2]；還可噴施于蘑菇和經濟林植物，可防治霜霉病、托拉斯假單胞桿菌（Pseudomonas tolaasii） 等各種病害[4]。

許多PGPR均含有ACC（一氨基環丙烷一羧酸）脫氨酶基因，能夠合成 ACC 脫氨酶，利用土壤內的ACC作為氮源，將ACC水解成氨和α-丁酮酸[5]，從而抑制乙烯的合成，以此解除乙烯對植物生長發育的抑制作用。本課題組長期對假單胞菌屬中的惡臭假單胞菌UW4進行研究，發現此菌亦含有ACC 脫氨酶，可與植物形成緊密的互惠關系。促使PGPR在植物根部定殖的主要因素有兩個：一是PGPR在與土著微生物的競爭中取得優勢；二是趨化作用，即白細胞沿濃度梯度向著化學刺激物作定向移動，正是由于植物根系源源不斷地分泌各種趨化物質，使得PGPR向根部游動并最終定殖下來。

假單胞菌屬的趨化信號通路與類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）相似，除了具有處于細胞端部的甲基趨化受體蛋白（MCP）復合體外，還有一個位于細胞質的受體復合體，鞭毛的運動同時受二者調控。惡臭假單胞菌F1的一個MCP蛋白能夠與三羧酸循環中的6個中間產物結合，對蘋果酸、延胡索酸、草酰乙酸和琥珀酸有高的親和力，并能產生強趨化反應，表明MCP對趨化物的親和力與趨化反應強度有關[6]。

本研究通過生物信息學軟件對惡臭假單胞菌UW4的MCP進行篩選，采用拓撲學軟件TOPCONS分析其是否具有跨膜結構域；采用NCBI中保守域軟件Conserved Domain 分析其是否具有HAMP（Histidine Kinases， Acdenylyl cyclases， Methy binding proteins， Phosphatases）及MCP-signal結構域，采用Phyre2.server軟件分析其N-末端是否具有配體結合結構域（LBD），符合以上3個結構特點的推測其可能為一個MCP，并對此MCP1進行了克隆和表達研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菌株：惡臭假單胞菌UW4（本實驗室保藏）。

菌種傳代及培養：LB液體及固體培養基。

克隆及表達載體：北京全式金生物pEASY-Blunt E1 Expression Kit； SanPrep 柱式質粒DNA 小量抽提試劑盒，上海生工生物工程有限公司；Pfu DNA polymerase：北京GenStar公司；

引物合成及測序：華大基因；克隆及表達菌株：北京莊盟國際生物基因科技有限公司DH5a及BL21（DE3）。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析 通過對NCBI中基因組的序列比對，在UW4中找到一個登錄號為WP_015093116.1 ，注釋為甲基受體趨化蛋白methyl-accepting chemotaxis sensory transducer [Pseudomonas sp. UW4]的蛋白質，使用TOPCONS軟件分析其是否具有跨膜結構域， NCBI中Conserved Domain 分析其是否具有HAMP及MCP-signal domain；使用Phyre2 server分析其N-末端是否具有配體結合結構域（LBD），最終確定其具備以上3個結構特征，推測可能為UW4的一個MCP1。

1.2.2 MCP的克隆及原核表達 根據pEASY-Blunt E1 Expression Kit載體特征，設計引物進行MCP1平末端片段的克隆，片段長度為1 917bp，引物序列如表1所示。

將克隆得到的MCP1片段進行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，連至pEASY-Blunt E1 Expression Kit，采用化學轉化法將此質粒轉入DH5a，挑取轉化子進行陽性克隆鑒定，將鑒定成功的pEASY-Blunt E1-MCP1重組質粒送測序，測序結果與目的片段同源率為100%。將此重組質粒轉入表達菌株BL21（DE3），挑取轉化子進行菌液PCR及質粒提取鑒定，將鑒定成功的帶有pEASY-Blunt E1-MCP重組質粒的BL21（DE3）以1%接種量接至含Amp的LB液體培養基中，37 ℃，220 rpm搖菌，培養至OD600=0.4～0.6，加入不同濃度（0.1～1.0 mmoL·L-1）的誘導劑IPTG，25 ℃過夜誘導使蛋白表達。

1.2.3 SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白 （1）樣品制備。取2 mL菌液，12 000 rpm離心2 min后重懸至2 mL PBS 緩沖液中，進行細胞破碎15 min，分出上清和沉淀后，將沉淀重懸至100 μL。將上清和沉淀樣品中分別加入5×上樣緩沖液，混合均勻后將其置于100 ℃沸水浴中煮沸10 min，后取出冷卻放置于-20 ℃備用。

（2）電泳過程。制備好分離膠及濃縮較后組裝好電泳系統，加入電極緩沖液，上樣約10 μL，接好電極開始電泳，開始電場強度為80 V，待染料進入分離膠后，將電場強度調至120 V，繼續電泳直至染料抵達分離膠底部，斷開電源。

（3）凝膠的固定及染色。取出膠片，用至少5倍體積的考馬斯亮藍染色液浸泡凝膠，放在搖床上室溫緩慢旋轉約20 min染色，染色完成后將凝膠置于脫色液浸泡，緩慢搖動4～8 h脫色，其間更換脫色液2～3次，至凝膠背景透明。將脫色后的凝膠照相或干燥保存。

2 結果與分析

2.1 MCP1克隆及測序

利用表1中的引物進行MCP1片段克隆，結果如圖1所示。

將鑒定成功的pEASY-Blunt E1 Expression Kit-MCP1重組質粒轉化子送測序（圖2），測序結果與目的片段同源率達100%。

2.2 構建表達菌株

將測序成功的重組質粒轉化入表達菌株BL21（DE3），后提取質粒鑒定轉化是否成功，結果如圖3所示。

將鑒定成功的表達菌株BL21（DE3）-MCP1以1%接種量接至含Amp的LB液體培養基中，37 ℃，220 rpm搖菌，培養至OD600=0.4～0.6，加入不同濃度（0.1～1.0 mmol·L-1）的誘導劑IPTG，25 ℃過夜誘導使蛋白表達。

2.3 SDS-PAGE電泳結果

將誘導完成的菌液取2 mL進行樣品前處理后，進行SDS-PAGE電泳觀察表達情況，電泳結果如圖4和圖5所示。

從上圖4和圖5中可以看出：MCP1在加入誘導劑IPTG 0.5～0.9 mmol·L-1時誘導效果良好，MCP1表達量較多，但主要以包涵體形式存在，上清中基本未見表達。

3 結論與討論

以上結果表明：克隆得到的MCP1可穩定表達，但多數在沉淀中，上清中表達量偏少。下一步嘗試采用低溫低速誘導方式，使MCP1能夠可溶性表達并采用固定金屬親和層析法分離純化得到有活性的純蛋白，然后通過等溫滴定（Isothermal titration calorimetry）和熱漂移試驗（Fluorescence-based thermal shift assay）分析MCPs與各類不同趨化物質（配體）之間親和力的大小即熱力學作用強弱，以期找出惡臭假單胞菌特異性的趨化受體，進一步闡明其趨化機理，為惡臭假單胞菌對植物的促生效應提供理論支撐。

參考文獻：

[1]TARIQ M， ALI Q， KHAN A， et al. Yield potential study of Capsicum annuum L.under the application of PGPR[J].Advancements in life sciences， 2014， 1（4）： 202-207.

[2]IPEK M ， PIRLAK L ， ESITKEN A， et al. Plant growth-promoting rhizobacteria （Pgpr） increase yield， growth and nutrition of strawberry under high-calcare-ous soil conditions [J]. Journal of plant nutrition， 2014， 37（7）： 990-1001.

[3]MAURHOFER M， REIMMANN C， SCHMIDLI P S， et al. Salicylic acid biosynthetic genes expressed in Pseu-domonas fluorescens strain P3 improve the induction of systemic resistance in tobacco against tobacco necrosis virus[J]. Phytopathology， 1998， 88（7）： 678-684.

[4]杜愛玲， 王進濤. 覆土微生物對雙孢蘑菇菌絲體生長的影響[J]. 華中農業大學學報， 1999， 18（3）： 242-244.

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[6]LACAL J， ALFONSO C， LIU X， et al. Identification of a chemoreceptor for tricarboxylic acid cycle intermediates differential chemotactic response towards receptor ligands[J]. Journal of biological chemistry， 2010， 285（30）： 23126-23136.