廣西地區荔浦芋新品種疫霉交配型和甲霜靈抗性研究

董偉清 江文 何芳練 高美萍 韋紹龍 蔣慧萍 閉志強 顏梅新

芋[Colocasia esculenta （L.） Schott]屬天南星科芋屬，為多年生宿根草本植物，原產于中國。芋具有很高的營養價值，其球莖富含淀粉、維生素和氨基酸等營養成分，是世界各地廣為栽培的蔬菜和糧食作物，也是可選的生物能源作物，許多品種還具有藥用價值[1]。目前廣西已成為全國芋頭的主要產區之一，其中以荔浦地區種植的荔浦芋尤為出名，擁有超340 a的栽培歷史，已成為我國地理標志產品。廣西壯族自治區農業科學院生物技術研究所選育的荔浦芋新品種桂芋2號，以其產量高、品質優、淀粉含量高、適應性廣等特點已成為廣西檳榔芋的主栽品種；但在栽培過程中常遭受芋疫病的為害，其品質和產量受到嚴重影響，給廣西芋頭產業造成嚴重的經濟損失。因此，開展桂芋2號芋疫病病原的研究，對桂芋2號生產和芋疫病防治具有重要意義。目前尚未見關于桂芋2號在不同生態栽培區芋疫霉的研究報道，本文以荔浦芋新品種桂芋2號在不同生態栽培區芋疫病標樣為研究對象，采用形態觀察和分子生物學手段鑒定其疫霉種類，通過與辣椒疫霉配合明確其交配型類型，并測定病原對甲霜靈的敏感性，為芋疫病的綜合防治及抗病育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 芋疫病樣本采集與病原菌分離

芋疫病樣本于2016年7～10月分別采集于南寧市、柳州市柳江區、桂林市荔浦縣青山鎮、賀州市賀街桂芋2號栽培區。病原菌分離采用常規組織分離法[2]。將具有芋疫病典型癥狀的病葉，從病健交接部位切取3 mm×4 mm大小的組織塊，經表面消毒（75%酒精10 s，0.1%升汞1 min，無菌水沖洗2～3次）后移入 10%V8 培養基上[3]，25℃培養 4～5 d，待平板長出菌絲后，挑取菌落邊緣單菌絲的尖端移入不加抗生素的10%V8培養基上進行純化。將純化后的菌株放入20℃的冰箱中保存備用。

1.2 病原菌的致病性測定

致病力測定參照周清平等[4]的方法，選取無病芋嫩葉置于室內搪瓷盤中，搪瓷盤事先放2層紗布，加適量的滅菌水保濕，在葉片選4個點，其中3個點分別滴加20 μL的106個/mL孢子的孢子懸浮液，另一個點滴加20 μL滅菌水作對照。點樣后套上塑料薄膜蓋住搪瓷盤保濕，于28℃恒溫培養箱中培養，4 d后觀察發病情況。對接種發病的芋葉組織進行病原菌再分離，觀察分離物是否與接種菌一致。

1.3 病原菌形態鑒定

病原菌形態鑒定參考李智軍等[5]方法，略有修改。將分離純化得到的菌株在10%V8培養基上28℃培養3 d后，切取菌落邊緣的菌絲塊移至10%V8培養基中央，放置生化培養箱中28℃培養3～5 d，觀察菌落形態，經光學顯微鏡觀察病原菌形態特征并拍照。

1.4 芋疫霉菌菌株ITS序列分析

芋疫病菌總DNA提取采用SDS裂解法。采用真菌核糖體轉錄間隔區通用引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 和 ITS5 （5'-GGAAGTAAAAGT CGTAACAAGG-3'）進行 PCR 擴增。PCR反應條件為：94℃預變性2 min，進入循環，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共30個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，UVP凝膠成像系統觀察和照相，PCR產物送上海英駿生物技術有限公司進行測序，測序結果用 Blast（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行DNA序列分析。

1.5 芋疫霉的交配型鑒定

將分離獲得的芋疫霉菌株及辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株、A2交配型S-5菌株（由中國農業大學植物病理學系劉西莉教授課題組惠贈）接種至10%V8培養基上，置于28℃恒溫箱中培養5 d。用消毒牙簽挑取大小約4 mm×4 mm的各待測菌株菌塊接種至10%V8培養基平板上，各待測菌株分別與辣椒疫霉A1或A2交配型菌株進行對峙培養[3,6]，兩菌絲塊相距30～40 mm，每處理設3皿重復，分別設芋疫霉菌株單株自身配對，辣椒疫霉A1和A2交配型菌株對峙培養及A1、A2菌株單株自身配對為對照。置于28℃下黑暗培養7 d，通過光學顯微鏡觀察是否產生卵孢子并拍照，從而鑒定芋疫霉菌株交配型類型。

1.6 芋疫霉對甲霜靈的敏感性測定

芋疫霉對甲霜靈的敏感性測定參考Goodwin等[7]的方法，略有修改。在10%V8培養基上培養5 d的疫霉菌株菌落邊緣切取直徑約5 mm的菌塊，分別接種至含甲霜靈0、5、100 mg/L的培養基平板中央，置28℃培養7 d，測量其菌落大小，每處理設3個重復?？剐詼y定標準參考Misra等[8]，甲霜靈濃度為5、100 mg/L的平板上菌落生長量均≥40%對照（甲霜靈濃度0 mg/L）生長量為抗性；兩者均≤40%對照生長量為敏感；甲霜靈濃度為5 mg/L平板上菌落生長量≥40%對照生長量≥甲霜靈濃度為100 mg/L平板上菌落生長量，為中度抗性。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

芋疫病主要為害葉片，也侵染葉柄。芋葉片上初生病斑為黃褐色圓形斑點，后逐漸擴大融合形成圓形或不規則形的大斑，病斑具有明顯的褐色同心輪紋，邊緣具水漬狀暗綠色或黃色暈圈。潮濕時病斑表面生灰白色霉層，并具有黃色至淡褐色膠質分泌物（圖 1）。

2.2 芋疫病病原菌的形態特征

從表現明顯癥狀的芋葉組織分離純化獲得8個菌株，在10%V8培養基上培養5 d后，8個菌株菌落基本一致。菌落圓形，邊緣整齊，整體呈淺黃至黃白色，氣生菌絲較少，無隔，無色透明，寬 3.80～6.84 μm。孢子囊卵形、長卵形、橢圓形，基部圓形，頂部有一乳頭狀突起（圖 2A、2B、2C）。 游動孢子（圖 2D）在孢子囊內產生，圓球形，通過排孢孔擠出，并迅速游動，每個孢子囊可以產生數個游動孢子。根據病原菌的培養性狀和形態特征，參照鄭小波[6]、陸家云[9]對疫霉的描述，初步將該病原菌鑒定為芋疫霉Phytophthora colocasiae。經致病性試驗，8個芋疫霉菌株致病力相當，所引起的癥狀與原癥狀相似，從接種組織中分離獲得的病原菌與原接種菌形態一致。

2.3 芋疫病菌分子生物學鑒定

以待測的8個芋疫霉菌株的總DNA為模板，采用ITS4和ITS5引物進行PCR擴增，結果發現所有測試菌株均獲得大小約為890 bp的產物。測序結果表明，所測序列與GenBank發表的Phytophthoracolocasiae不同分離物序列同源性達99%，進一步確定所測菌株均為芋疫霉（P.colocasiae）。

圖1 芋疫病癥狀

2.4 芋疫霉交配型的鑒定

芋疫霉待測菌株分別與辣椒疫霉A1、A2交配型菌株對峙培養7 d后（圖 2E），利用消毒牙簽挑取兩菌交界處的菌絲放在玻片上置于顯微鏡下觀察卵孢子。結果發現所有待測的8個芋疫霉菌株和辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株的對峙培養均可觀察到卵孢子的產生（圖2F），說明待測的8個芋疫霉菌株均屬于A2交配型，對照辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株和A2交配型S-5菌株對峙培養可觀察到卵孢子（圖2G），而待測8個芋疫霉菌株與A2交配型S-5菌株對峙培養，8個芋疫霉菌株、辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株及A2交配型S-5菌株單獨培養均未發現卵孢子，說明8個芋疫霉菌株不屬于A1交配型或其他交配型。

2.5 芋疫霉對甲霜靈的敏感性

8個芋疫霉菌株在甲霜靈0 mg/L濃度處理下，28℃培養7 d后菌落長滿整個培養皿，而在甲霜靈5 mg/L和100 mg/L濃度處理下，8個芋疫霉菌株菌落直徑大小均為0 mm。

圖2 芋疫霉形態特征

3 討論

傳統的疫霉鑒定主要根據菌落、有性器官、孢子囊、孢囊梗等形態特征進行[10]。由于疫霉菌形態特征會因培養條件不同而存在差異，加之自身形態具有較大的變異性，給疫霉的分類鑒定帶來一定難度。隨著分子生物學鑒定手段運用于疫霉的分類鑒定中，許多報道已經證實疫霉菌5.8S rDNA ITS區域是一段穩定、保守而又具有種間特異性的基因區域，可以通過該區域設計特異性引物對疫霉進行分子鑒定[10～12]。陸葉等[3]對來源于我國廣西桂東南地區的疫病霉株ITS序列進行分析，所測序列與GenBank發表的P.colocasiae不同分離物序列同源性高達97%～100%。而本研究結合形態特征和分子生物學手段對不同生態栽培區的桂芋2號芋疫霉菌菌株進行了鑒定，所測ITS序列與NBCI上公布的芋疫霉菌分離物同源性達99%。

芋疫病病原早于1890年在印度尼西亞被鑒定為Phytophthora colocasiae[13]，該菌屬于疫霉屬（Phytophthora），有性生殖營卵配生殖，屬異宗配合，一般需要兩種不同交配型菌株進行有性生殖產生卵孢子，而卵孢子是疫霉菌度過不良環境及越冬的主要菌態[3]。Ko[14]對來自夏威夷101個芋疫霉菌株進行分析，發現這些芋疫霉菌株均為A1交配型，而另外來自亞洲的5個芋疫霉菌株則鑒定為A2交配型。Ann等[15]對采集自中國臺灣的799個芋疫霉分離物進行交配型鑒定，發現所有測試菌株均為A2交配型，作者認為臺灣不是芋疫霉菌的起源地。而Lin等[16]對臺灣芋疫霉菌研究發現絕大部分菌株屬于A2交配型，另外，在某些地方還發現了A1A2交配型菌株，并通過無性培養獲得了A1交配型菌株，作者認為臺灣芋疫霉在某些地方存在遺傳多樣性的可能。Zhang等[17]對我國海南芋疫霉菌進行研究，結果表明海南芋疫霉存在著豐富遺傳多樣性，280個芋疫霉菌株中A1交配型菌株有136個,102個菌株為A2，而42個菌株為A0交配型，據此作者認為我國海南為世界芋疫霉的起源中心。據報道，印度北部芋疫霉也存在豐富的多樣性，到目前為止發現 A1交配型和 A2交配型同時存在[8，18，19]。陸葉等[3]對廣西桂東南地區的芋疫霉菌株進行交配型測定，結果發現所有芋疫霉菌株均屬于A2交配型。本研究分離獲得的8個芋疫霉菌株交配型均為A2交配型，與陸葉等研究結果相似。因此推斷，這些地區桂芋2號芋頭產區田間芋疫霉發生有性生殖的可能性非常低。

化學防治是防治疫病的重要措施之一，而甲霜靈是防治疫病比較有效的藥劑之一，但在20世紀90年代開始陸續報道一些疫霉對該藥劑產生了抗藥性，如Phytophthora parasitica[20]，Phytophthora infestans[21]。對于芋疫霉抗藥性，Misra等[8]報道在印度分離到一株芋疫霉98-111對甲霜靈產生了抗藥性，說明芋疫霉已經開始對甲霜靈產生了抗藥性。而本研究的芋疫霉菌對甲霜靈非常敏感，在5 mg/L濃度下生長受到抑制。

4 結論

芋疫病主要以帶菌球莖為初侵染源，發病部位上產生的孢子囊和游動孢子通過氣流和雨水擊濺傳播，成為病害發生與流行的主要因素。對于4個桂芋2號栽培區的疫病采用因地制宜的防治措施，建議與玉米、水稻、姜等作物輪作、間作，同時注意避免與茄科、葫蘆科、豆科等辣椒疫霉的寄主輪作、間種。種植脫毒健康種苗，減少病害的發生。此外，甲霜靈仍可作為化學防治的主要藥劑，建議與其他藥劑交替使用。

[1]趙國華，陳宗道，王赟.芋頭多糖的理化性質及體內免疫調節活性研究[J].中國食品學報，2002，2（3）：21-25.

[2]方中達.植病研究方法[M].3版.北京：中國農業出版社，1998.

[3]陸葉，陸志翔，何芳練，等.桂東南地區芋疫霉的交配型研究[J].基因組學與應用生物學，2013（3）：285-290.

[4]周清平，胡漢橋，梁鉀賢，等.芋疫病抗病性鑒定及藥劑篩選[J].湖北植保，2012（5）：27-30.

[5]李智軍，龍衛平，鄭錦榮，等.廣東辣椒疫霉菌分離鑒定及其致病力和生理小種分化研究 [J].華南農業大學學報，2007，28（1）：50-54.

[6]鄭小波.疫霉菌及其研究技術[M].北京：中國農業出版社，1997.

[7]Goodwin S B,Sujkowski L S,Fry W E.Widespread distribution and probable origin of resistance to metalaxyl in clonal genotypes ofPhytophthora infestansin the United States and Western Canada[J].Phytopathology,1996,86(7):793-800.

[8]Misra R S,Mishra A K,Sharma K,et al.Characterisation of Phytophthora colocasiaeisolates associated with leaf blight of taro in India[J].Archives of Phytopathology&Plant Protection,2011,44(6):581-591.

[9]陸家云.植物病原真菌學[M].北京：中國農業出版社，2001.[10]程亮，溫國泉，吳永官，等.廣西南瓜疫病的病原分離與鑒定[J].西南農業學報，2014，27（6）：2 398-2 401.

[11]王源超，張正光，鄭小波．核糖體基因ITS作為芝麻疫霉、惡疫霉分類輔助性狀的研究[J].菌物系統，2000，19（4）：485-491．

[12]李衛民，晏衛紅，黃思良，等．廣西黑皮冬瓜疫病的病原菌鑒定及其生物學特性[J].植物病理學報，2007，37（3）：333-336．

[13]Misra R S,Sharma K,Mishra A K.Phytophthora leaf blight of taro (Colocasia esculenta)-A review[J].The Asian and Australasian Journal of Plant Science and Biotechnology,2008,2:55-63.

[14]Ko W H.Mating-type distribution ofPhytophthora colocasiaeon the Islands of Hawaii[J].Mycologia,1979,71(2):434-437.

[15]Ann P J,Kao C W,Ko W H.Mating type distribution of Phytophthora colocasiaein Taiwan [J].Mycopathologia,1986,93(3):193-194.

[16]Lin M J,Ko W H.Occurrence of isolates ofPhytophthora colocasiaein Taiwan with homothallic behavior and its significance[J].Mycologia,2008,100(5):727.

[17]Zhang K M,Zhang F C,Li Y D,et al.Isolates of Phytophthora colocasiaefrom Hainan Island in China evidence suggesting an Asian origin of the species[J].Mycologia,1994,86(1):108-112.

[18]Narula K L,Mehrotra R S.Occurrence of A1 mating type ofPhytophthora colocasiae [J].Indian Phytopathology,1980,33(4):603-604.

[19]Tyson J L,Fullerton R A.Mating types ofPhytophthora colocasiaestrains from the Pacific region,India and Southeast Asia[J].Australasian Plant Disease Notes,2007,2:111-112.

[20]Deahl K L,Inglis D A,DeMuth S P.Testing for resistance to metalaxylin Phytophthora infestansisolatesfrom Northwestern Washington [J].American Potato Journal,1993,70:779-795.

[21]畢朝位，車興壁，馬金成，等.致病疫霉對甲霜靈抗性及抗性水平測定[J].西南大學學報：自然科學版，2002，24（4）：307-309.