Snail與Claudin-3蛋白的表達與原發性肝癌發生及預后的關聯性研究

申燕軍 陳京龍 車娟娟 王 婧 曹邦偉*

(1. 首都醫科大學附屬北京友誼醫院腫瘤中心，北京 100050；2. 首都醫科大學附屬北京地壇醫院腫瘤科，北京 100015)

原發性肝癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)在消化系惡性腫瘤中是發展比較快、臨床治療效果較差的惡性腫瘤之一；其病死率全球居第3位，在腫瘤相關死亡中僅次于肺癌，位于第2位[1-2]。在眾多的腫瘤增生與侵襲的分子通路中，上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的發生、發展中起著重要的作用，而其中Snail與Claudin-3則是EMT通路中的關鍵蛋白[3-4]。因此，探討Snail與Claudin-3蛋白與惡性腫瘤的發生與預后具有重要的臨床意義。目前尚未有涉及Snail和Claudin-3蛋白的表達與肝細胞癌的相關性研究。因此，針對上述兩種EMT通路中的關鍵蛋白進行了肝細胞癌中的表達檢測，以期探索其表達狀態與肝細胞癌臨床特征的關聯性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取首都醫科大學附屬北京地壇醫院與附屬北京友誼醫院2008年2月至2015年12月進行根治性切除的HCC病例，其中臨床資料完整、石蠟組織完好的HCC病例82例，另取其對應的60例離切緣大于5 cm癌旁正常組織作為對照。納入標準：接受根治性肝癌切除術，術后病理診斷為原發性肝細胞癌；Child-Pugh分級為A-B級、且無遠處轉移與肝性腦病；術前均未行相關抗腫瘤治療。排除標準：肝功能Child-Pugh C級、HCC合并遠處轉移、非原發的肝轉移性癌。收集入組患者臨床資料，包括一般狀況、腫瘤大小、位置、肝功儲備，并進行規律隨訪，登記患者的疾病進展時間、生存時間。

1.2 材料與方法

兔抗人Snail多克隆抗體(ab117866)，兔抗人Claudin-3多克隆抗體(ab15102)，免疫組織化學試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術開發有限公司。所有標本均經過10%(體積分數)甲醛固定、石蠟包埋，嚴格按技術規范手冊進行實驗操作。分別用已知的結腸腺癌和胃腺癌組織作為Snail、Claudin-3蛋白表達的陽性對照；PBS代替一抗為陰性對照。

1.3 免疫組織化學結果判定

Snail以細胞核或細胞質出現棕黃色染色為陽性細胞；Claudin-3以細胞膜或細胞質出現棕黃色為陽性細胞。根據陽性細胞占腫瘤細胞的百分比以及著色程度判斷：無明顯陽性細胞或著色細胞數<10%為陰性(-)，陽性細胞數≥10%或著色較強者為陽性(+)。

1.4 統計學方法

應用SPSS 22.0進行統計分析。計數資料采用頻數和百分數表示，獨立樣本比較采用χ2檢驗，配對樣本比較采用McNemar檢驗。相關性采用Spearman秩和相關系數表示。對生存數據進行 Kaplan-Meier分析和 Log-rank 檢驗，并繪制生存曲線。采用Cox回歸比例風險模型進行生存數據的多因素分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入組患者Snail與Claudin-3蛋白表達率

Snail陽性表達主要見于HCC細胞核或/和細胞質中；Claudin-3陽性表達主要見于HCC細胞膜或/和細胞質中。82例HCC組織，其中39例癌組織Claudin-3染色陽性(圖1A)，陽性率為 47.61%。60例癌旁組織，其中47例陽性(圖1B)，陽性率為78.31 %。兩者差異有統計學意義(P=0.002)。82例HCC組織，其中57例癌組織Snail染色陽性(圖1C)，陽性率為69.47%。60例癌旁組織，其中22例陽性(圖1D)，陽性率為36.58%。兩者差異有統計學意義(P=0.001)，詳見表1。

2.2 Snail和Claudin-3蛋白表達與HCC臨床病理學特征的關系

Snail和Claudin-3兩者的表達水平呈負相關(r=-0.430，P<0.01)。但其表達均與微血管侵犯明顯相關，差異具有統計學意義(χ2=60.37,P=0.001;χ2=16.38,P=0.011)。同時Snail和Claudin-3表達與病理分期(pathology tumor lymph node metastasis, pTNM)較晚的分期有一定的相關性，差異同樣具有統計學意義(χ2=5.90,P=0.015;χ2=4.91,P=0.027)。而年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、肝硬化等差異無統計學意義(P>0.05),詳見表2。

表1 Snail與Claudin-3蛋白在HCC癌組織與癌旁組織中的表達Tab.1 Expression of Snail and Claudin-3 protein in HCC or adjacent liver tissues n(%)

HCC：hepatocellular carcinoma.

圖1 免疫組織化學法檢測肝癌組織Claudin-3與Snail的表達Fig.1 Expression of Claudin-3 and Snail in HCC by immunohistochemical(200×)

A: expression of Claudin-3 in HCC;B: expression of Claudin-3 in normal liver tissues;C: expression of Snail in HCC ;D: expression of Snail in normal liver tissues;HCC:hepatocellular carcinoma.

表2 Snail與Claudin-3蛋白的表達與肝癌臨床病理特征的關系Tab.2 Relationship between the expression of Snail or Claudin-3 protein and thepathological characteristics of HCC

2.3 Snail和Claudin-3表達與HCC預后的關聯

分別比較Claudin-3與Snail表達陽性、陰性HCC患者的生存數據。Snail表達陽性、陰性的5年生存率分別為21.89%、37.11%；兩組生存率差異有統計意義(P=0.001)。Claudin-3表達陽性、陰性的5年生存率分別為36.72%、21.70%。兩組生存率差異有統計學意義(P=0.001)，詳見圖2。

2.4 HCC患者生存的獨立危險因素分析結果

多因素分析顯示Snail、Claudin-3蛋白的表達是能夠影響肝癌術后生存期的獨立因素。相對危險度的統計結果顯示Snail陽性HR=3.12(95%CI: 2.57～3.78)；Claudin-3陽性HR=0.59(95%CI: 0.53～0.67)。表3中的結果顯示腫瘤大小、病理分級、TNM分期、微血管侵犯等也是影響預后的獨立危險因素。

3 討論

EMT是指腫瘤細胞由上皮表型向間質表型轉化的過程，具有去分化特征。上皮細胞極性喪失主要體現為蛋白標記的丟失，如：E-cadherin、Claudin、Occludins、Mucl等；其中E-cadherin在上皮細胞間黏附起著重要的作用，Claudin能維持細胞的完整性[5]。因而E-cadherin、Claudin的表達減少或不表達可使腫瘤細胞的轉移、侵襲能力增強，故在腫瘤的發生、發展的過程中發揮重要作用[6-7]。Snail蛋白表達同樣可以調控EMT，它主要通過抑制E-cadherin、Claudin的表達來促進EMT發生[8]。Claudin是組成緊密連接(tight junction, TJ)的骨架蛋白，有維持細胞的屏障功能。Claudin-3是其家族成員之一。已有研究[9-12]顯示，Claudin在不同的腫瘤中發揮的作用各異，Claudin-3在某些惡性腫瘤中表達升高，如胃癌、結腸癌、卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌等；而另一些癌癥中下調，如肺鱗癌及三陰乳腺癌[13]。

圖2 HCC患者中Snail與Claudin-3的表達與預后的生存分析Fig.2 Survival analysis of HCC patients with or not expressionA: Snail; B: Claudin-3；HCC:hepatocellular carcinoma.

Single factor analysisPHR(95%CI)Multifactor analysisPHR(95%CI)Age0.7700.99(10.99-1.01)Gender0.1641.09(0.97-1.22)Hepatocirrhosis0.9951.01(0.99-1.09)Stages of pTNM<0.0012.11(1.98-2.25)0.0011.74(1.59-1.91)Edmondson-Steiner0.0011.44(1.31-1.59)<0.0011.88(1.68-2.09)Tumor size0.0013.42(2.95-3.97)0.0031.62(1.31-2.01)Microvascular invasion0.0161.12(1.02-1.22)<0.0011.72(1.43-2.06)Expression of Snail0.0102.19(2.00-2.39)<0.0013.12(2.57-3.78)Expression of Claudin-30.0010.52(0.47-0.56)<0.0010.59(0.53-0.67) TNM: tumor lymph node metastasis;HCC:hepatocellular carcinoma.

本課題組研究顯示，在HCC中Claudin-3蛋白表達的陽性率低于癌旁組織，其表達在微血管侵犯、pTNM分期相關方面有相關性且差異有統計學意義(P<0.05)。提示Caudin-3低表達HCC腫瘤細胞的侵襲能力較強。在多因素分析中，Claudin-3是影響肝癌患者生存的獨立危險因素，并且Claudin-3低表達患者的5年生存率明顯較低，表明Claudin-3低表達的HCC患者的預后較差。同時本研究表明，Snail蛋白在HCC中陽性表達明顯高于癌旁組織，在pTNM分期、微血管侵犯相關方面差異有統計學意義(P<0.05)；結果提示在Snail高表達時，HCC腫瘤細胞具有較強的侵襲性。另外，在多因素分析中Snail蛋白也同樣是可影響患者生存的獨立危險因素，且在Snail蛋白高表達時5年生存率明顯偏低。本研究中顯示Claudin-3與Snail蛋白的表達兩者呈負相關，進一步在臨床數據中印證了Snail與Claudin-3蛋白與HCC的發生、侵襲的關聯。因此進行HCC患者Snail、Claudin-3蛋白的聯合檢測，在臨床實踐中對HCC患者病理學特征與預后的判斷具有重要的提示作用；對Snail高表達與Claudin-3低表達的HCC患者術后應密切隨診。

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