淺析影響注射用水溶性維生素中B12含量的因素

査文勇 陸曉燕 趙雙雙

（上海上藥第一生化藥業有限公司，上海200240）

0 引言

維生素B12，又稱為鈷胺素，是唯一含有金屬元素的維生素。自然界中的維生素B12都是微生物合成的，高等植物和動物不能制造維生素B12。同時，維生素B12是唯一一種需要腸道分泌物（內源性因子）幫助才能被吸收的維生素。有些人由于腸胃異常，缺乏這種內源性因子，即使有足夠的食物來源，他們仍會患上惡性貧血。在目前已知的植物性食品中基本上都不含有維生素B12，且其停留在腸道的時間很長，大約需要3h（大部分水溶性維生素只需幾秒鐘）才能被吸收。

維生素B12的主要生理功能是參與制造骨髓紅細胞，預防惡性貧血以及腦損傷。維生素B12是淺紅色針狀結晶，易溶于水和乙醇，但是不溶于丙酮、乙醚或氯仿。其在pH值為4.5～5.0的弱酸條件下最穩定，在強酸（pH=2）或堿性溶液中會分解，遇熱會少量受損，但短時間的高溫消毒損失小，遇強光或紫外線易被破壞，普通蒸煮過程的損失量約為30%。

本文主要考察影響注射用水溶性維生素中B12含量的因素，通過比較兩種不同的配制方法，擇優選取其中一種，使得產品的合格率得到顯著提升。

1 實驗材料和設備

1.1 實驗材料

1.1.1 處方組成

注射用水溶性維生素的處方組成如表1所示。

1.1.2 試劑

磷酸二氫鉀（批號20170109），國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（批號17070452），TEDIA公司；10%鹽酸溶液（批號170922）、磷酸二氫鉀（批號T20100804），國藥集團化學試劑有限公司；磷酸氫二鉀（批號F20100813），國藥集團化學試劑有限公司；磷酸（批號20170109），國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 對照品

煙酰胺（含量99.9%），批號100115-201604；硝酸硫胺（含量99.8%），批號100297-201402；鹽酸吡哆辛（含量100.0%），批號100116-201404；泛酸鈉（含量99.9%），批號100279-201203；維生素C鈉（含量99.9%），批號100296-201104；維生素B12（含量90.2%），批號100248-201203。

1.2 儀器和設備

不銹鋼鋼桶、攪拌棒、不銹鋼鋼勺、玻璃棒、燒杯、不銹鋼杯子、剪刀、不銹鋼棒；Agilent1200型高效液相色譜儀，安捷倫公司；ME104型天平、AB135-S型天平，梅特勒公司。

表1 處方組成

2 方法和結果

2.1 配制方法和測定方法

2.1.1 配制方法

2.1.1.1 方法1配制過程

（1）準確稱取配制總量80%的注射用水（水溫控制在65～70℃）置于160L不銹鋼桶中，通氮氣（有氣體冒出即可）5min后，分別取其中的1L注射用水置于兩只塑料勺中（水溫控制在60～65℃），將配制量的維生素B12（注意避光）加入至塑料勺中，用玻璃棒不斷攪拌5min后沉淀約5min，視其全部溶解，將配制量的生物素加入至另一塑料勺中，用玻璃棒攪拌使其全部溶解，混合后即得溶液1。

（2）將配制量的甘氨酸、尼泊金甲酯、依地酸二鈉、核黃素磷酸鈉（注意避光）、煙酰胺、葉酸、硝酸硫胺、鹽酸吡哆辛、右旋泛酸鈉，按順序逐一投入至上述160L的不銹鋼桶中，每投一種原輔料后均需充分攪拌均勻，使其全部溶解，然后再投入下一個原輔料，溶液攪拌均勻后，即得溶液2。

（3）仔細觀察溶液1藥液澄清后，將其并入溶液2中，并用不銹鋼棒攪拌均勻后得到溶液3。

（4）準確稱取配制總量20%的注射用水（水溫控制在30～40℃）置于40L不銹鋼桶中，通氮氣（有氣體冒出即可）5min，將配制量的維生素C鈉投入其中，并用不銹鋼棒攪拌均勻，使其溶解，然后并入溶液3（水溫控制在30～40℃）中，通氮氣（有氣體冒出即可）5min，并攪拌均勻。

（5）QA人員取樣后，送給質量檢驗員進行中間體（藥液）的分析，測pH值。

2.1.1.2 方法2配制過程

（1）準確稱取配制總量80%的注射用水（水溫控制在60～70℃）置于配液罐中，通氮氣（有氣體冒出即可）5min后，取其中的1L注射用水置于玻璃燒杯中，將處方量的生物素加入至玻璃燒杯中，用玻璃棒攪拌使其全部溶解，即得溶液1。

（2）在配液罐中加入處方量的甘氨酸，攪拌使其完全溶解，再依次加入處方量的對羥基苯甲酸甲酯、依地酸二鈉、核黃素磷酸鈉（注意避光）、煙酰胺、葉酸、硝酸硫胺、鹽酸吡哆辛、泛酸鈉，按順序逐一投入至上述配液罐中，每投一種原輔料后均需充分攪拌均勻，使其全部溶解，然后再投入下一個原輔料，溶液攪拌均勻后，即得溶液2。

（3）仔細觀察溶液1藥液澄清后，將其并入溶液2中，攪拌并降溫至20～30℃。

（4）準確稱取配制總量20%的注射用水（水溫控制在20～30℃）置于不銹鋼桶中，通氮氣（有氣體冒出即可）5min后，取其中的1L注射用水置于玻璃燒杯中，將處方量的維生素B12（注意避光）加入至玻璃燒杯中，用玻璃棒攪拌使其全部溶解，并繼續攪拌10min，即得溶液3。

（5）將處方量的維生素C鈉投入至上述不銹鋼桶中，并攪拌均勻，使其溶解，然后將該溶液并入配液罐。

（6）仔細觀察溶液3藥液澄清后，將其并入配液罐中，并用不銹鋼棒攪拌均勻后，通氮氣（有氣體冒出即可）5min，攪拌均勻（約10min），測定其pH值應在5.8～6.1。

2.1.2 維生素B12測定

2.1.2.1 色譜條件

維生素B12測定方法的色譜條件如表2所示，梯度比例如表3所示。

2.1.2.2 溶液配制

（1）對照品溶液：取維生素B12對照品約25mg，精密稱定，置于250mL量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，搖勻；精密量取1mL，置于100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。（2）供試品溶液：取本品5瓶，用適量水溶解后轉移至同一25mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制兩份供試品溶液。

2.1.3 測定法

2.1.3.1 空白試驗

取冷卻至常溫的注射水，至少進樣1針，確認其對測試無干擾。

2.1.3.2 系統適用性試驗

取對照品溶液，連續進樣5針，記錄色譜圖，計算維生素B12峰面積平均值及RSD值，RSD值應不大于2.0%。理論塔板數以維生素B12峰計算，應不低于2000，維生素B12與未知峰之間的分離度應該大于1.0。

表2 色譜條件

表3 梯度比例

2.1.3.3 供試品溶液的測定

取供試品溶液，每份溶液進樣1針，記錄色譜圖。

2.1.4 計算與結果判斷

以外標法計算：

式中——連續5針對照品溶液主峰平均峰面積；

Ax——供試品溶液主峰峰面積；

Cr——對照品溶液的濃度，mg/mL；

mr——標準品稱樣量，mg。

每瓶注射用水溶性維生素中含維生素B12應為4.5～6.0μg。

2.2 實驗結果

注射用水溶性維生素的兩種配制方法中，維生素B12的含量測定結果如表4所示。

2.3 液相圖譜

對每批樣品都做了兩遍平行實驗，從液相圖譜（由于篇幅有限，本文不再贅述）中可以看出，得出的結果是一致的，說明測定結果是可靠的。

3 結語

從以上分析結果可以看出，配制方法1明顯優于方法2，說明維生素C鈉可能影響維生素B12的穩定性。此外，在方法1中主要控制了維生素C鈉溶液的溫度以及維生素C鈉溶液加入維生素B12混合前的溫度，這樣可以極大地避免維生素C鈉對維生素B12造成損害，說明方法1的配制工藝科學、合理、有效，既能生產出合格穩定的產品，又能降低生產風險，幫助企業提高經濟效益。

表4 注射用水溶性維生素的兩種配制方法結果

從表4可以看出：用方法1配制出來的注射用水溶性維生素中的B12含量基本上能夠達到5.0μg以上；而用方法2配制出來的注射用水溶性維生素中的B12含量基本上都未能夠達到5.0μg。由此說明，配制方法1明顯優于方法2。