一例仔豬藍耳病與副豬嗜血桿菌病混合感染的診斷

周晨陽

（遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽110164）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRSV感染引起的以妊娠母豬發生早產、流產、產死胎、弱仔、木乃伊胎等繁殖障礙和各年齡段豬呼吸道疾病為主要特征的病毒性傳染病[1-2]，在我國，該病俗稱“豬藍耳病”，該病呈全球性分布，給全球養豬業造成了嚴重的經濟損失。20世紀80年代末，該病最先在美國暴發，引起豬群發生“流產風暴”，因為當時病因不明，該病被稱為“神秘豬病”，1991年荷蘭學者首次分離到該病的病原，確定為一種新型的RNA病毒[3]，1992年正式將該病統一命名為“豬繁殖與呼吸綜合征”。我國于1996年首次發現該病并分離到病毒[4]，隨后該病在我國迅速傳播并廣泛流行，給我國養豬業造成巨大經濟損失。PRRSV主要感染單核細胞和完全分化的豬肺泡巨噬細胞[5]，健康豬感染PRRSV后，2～14周內都會向外排毒，易感豬可通過口、鼻腔、藥物注射等多種途徑感染病毒，懷孕母豬感染后妊娠后期流產率達50%～70%，仔豬死亡率至少達35%[6]。因此，該病是養豬業威脅最大的傳染病之一。

副豬嗜血桿菌病由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuisis，Hps）引起，以多發性纖維素性漿膜炎和關節炎為主要特征，該病也被稱為豬革拉澤氏病（Glsser′s disease）[7-8]。Hps屬于革蘭氏陰性菌，兼性厭氧菌，細菌形態呈現出多形性桿狀，該菌生長需要依賴NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），與金黃色葡萄球菌共培養時會出現衛星現象。該菌體外培養條件極為苛刻，首次分離最好在5%CO2培養箱中培養，在培養基中還需加入5%的血清和0.01%的NAD。正因如此，該菌的分率小于檢出率。該病通常情況下常與病毒病混合感染，例如藍耳病、豬瘟、豬偽狂犬等。當免疫力低下時，該病就會爆發。目前，根據血清學分型，該菌一共有1～15個血清型，其中1、5、10、12、13、14為強度株；2、4、8、15為中毒株；其余為弱毒株。根據流行病學調查我國流行株為4、5、13型，該病的發病率為10%～15%，但死亡率可達50%[9]。因此，Hps也是豬細菌病之中威脅最大的疾病之一。

2017年10月份，遼寧地區遼陽市某豬場斷奶仔豬出現體溫升高，呼吸困難，被毛松亂，仔豬大量死亡，個別仔豬耳朵發紫，關節腫大。對仔豬剖檢發現，胸腔積液，肺臟條帶狀或點狀出血、間質增寬，有大量纖維素性滲出，個別豬胸膜與肺粘連，絨毛心，腹腔見纖維素性滲出，腸管由纖維素性滲出物黏成一團，關節液增多、混濁。從臨床癥狀和剖檢變化看，懷疑豬繁殖與呼吸綜合征同副豬嗜血桿菌混合感染。無菌采集病料后，通過細菌分離培養、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗鑒定、PCR檢測，最終確定為經典豬藍耳病和副豬嗜血桿菌病混合感染。

1 材料與方法

1.1 病料采集 無菌采集新鮮的肺臟、心臟、淋巴節及關節液病料，供實驗室診斷使用。

1.2 培養基及主要試劑 胰蛋白大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和優級胎牛血清購自于北京索萊寶科技有限公司；反轉錄試劑盒購自于大連寶生物科技有限公司；2×Taq PCR MasterMix購自于北京艾德萊生物科技有限公司；TriZol up、DNA Marker DL 2000均購自于北京全式金生物技術有限公司；葡萄糖、吲哚、果糖等生化管購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 引物 經典豬藍耳病引物參照高琦等[10]使用的引物進行合成；副豬嗜血桿菌引物使用該菌特定的16SrRNA序列擴增引物，序列如表1，引物由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物Table 1 Primer

1.4 病料處理 將肺臟、心臟、淋巴結各取0.1 g，一起放入滅菌研缽中，每次加入適當液氮，將病料碾磨成粉，取適當病料粉末（約0.1 g）裝入1.5 mL除酶離心管中，加入1 mL TriZol up，用槍反復抽吸，室溫放置5 min；加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫孵育3 min；10 000 r/min 4℃離心15 min；吸取上層透明液體400 μL放入已預冷的1.5 mL除酶離心管中，加入500 μL預冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫孵育10 min；10 000 r/min 4℃ 離心10 min，將上清液全部棄掉；加入1 mL預冷的75%的乙醇，漩渦震蕩；7 500 r/min，4℃離心10 min；棄上清，室溫晾干管內乙醇；加入50 μL RNA溶解液；55℃孵育10 min。保存-70℃保存。

1.5 反轉錄 根據大連寶生物反轉錄試劑盒Prime-Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser說明書進行PRRSV核酸反轉錄操作。

1.6 細菌分離培養 將無菌采集的新鮮病料立刻帶回實驗室進行細菌分離，在超凈工作臺中利用無菌手術刀將肺臟、心臟切開，取適當大小的深層組織平板涂布于TSA培養基中，每個組織涂布3個平皿。吸取100 μL關節液直接涂布在TSA培養基中，做3個重復。接完平皿后放入5%的CO2培養箱37℃倒置培養18 h。

1.7 菌落形態觀察及革蘭氏染色 將生長出來的菌落進行觀察，查看是否有與副豬嗜血桿菌相似的菌落，正常副豬嗜血桿菌的菌落直徑約為1 mm左右，液滴狀，半透明，邊緣整齊。挑取單個菌落放入200 μL滅菌離心管中，加入10 μL生理鹽水，混合均勻。吸取2 μL菌液進行革蘭氏染色；結晶紫1 min，碘液1 min，95%酒精40 s，石炭酸復紅1 min。

1.8 生化鑒定 將疑似菌落繼續劃線培養，挑取單個菌落接入生化試劑管中，每個生化試管中加入5 μL的0.01%NAD，37℃培養12 h。

1.9 細菌基因組DNA提取 用2 mL滅菌蒸餾水將TSA平皿中細菌洗下，5 000 r/min離心5 min，去上清，再加入200 μL滅菌蒸餾水，混勻后100℃煮沸10 min，立即放入-20℃冷凍10 min，取出融后，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為模板DNA。

1.10 PCR鑒定 豬藍耳病和副豬嗜血桿菌PCR反應體系為（20 μL）：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上游引物、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。經典藍耳病PCR擴增反應程序為：94℃，2 min；94℃，30 s，54℃，30 s，72℃，30 s，30個循環；72℃，5 min。副豬嗜血桿菌PCR擴增程序為：94℃，3 min；94℃，30 s，59℃，30 s，72℃，1 min，30個循環；72℃，5 min。擴增結束后各取5μL產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.11 藥敏試驗 將分離出來的副豬嗜血桿菌在TSA平皿中均勻涂布，正置30 min后，貼入藥敏試紙片（頭孢呋辛、卡那霉素、青霉素等10種藥物）。37℃倒置培養16 h后，測量抑菌圈大小，根據結果判定敏感程度。

2 結果與分析

2.1 剖檢變化 剖檢病豬發現，淋巴結腫大充血，胸腔積液增多，肺臟肉樣變，心包膜增厚，心包液增多，病豬脾臟腫大、淤血、邊緣壞死，顏色呈暗紅色，肝臟和腸道有明顯的出血點。切開關節后發現，關節積液，內有干酪樣物質，如圖1（A-D）。

圖1 剖檢變化Fig.1 Clinical symptoms

圖2 細菌分離鑒定結果Fig.2 Bacteria isolation and identification results

2.2細菌分離及革蘭氏染色結果 將生長出邊緣整齊、半透明、液滴狀、直徑約為1 mm的菌落挑出繼續劃線增菌（如圖2-A）。革蘭氏染色發現該菌為革蘭氏陰性菌，形態為長短不一、無芽孢、不規則排列桿狀（如圖2-B）。

2.3 生化鑒定結果 將培養的細菌接入以下生化試劑管，37℃培養12 h后觀察變化，結果與副豬嗜血桿菌生化特性相符，如表2。

表2 生化試驗Table 2 biochemical tests

2.4 PCR結果PCR鑒定結果表明，經典豬藍耳病病毒和副豬嗜血桿菌在相應位置出現目的條帶，并且陰性對照未出現條帶，如圖3。

圖3 PCR電泳分析圖Fig.3 PCR electrophoresis analysis chart

2.5 藥敏試驗結果 觀察抑菌圈直徑大小，參考劉麗穎等[11]判定副豬嗜血桿菌對抗生素是否耐藥性。判斷標準為抑菌圈直徑小于20 mm為不敏感，20～30 mm為中度敏感，30 mm以上為高度敏感，結果見表3。

表3 藥敏結果Table 3 The results of drug susceptibility

3 討論

本試驗通過對發病死亡仔豬進行剖檢，根據發病死亡豬臨床癥狀、病理變化，結合采集的新鮮病料進行實驗室檢測，最終鑒定出該例病例為經典豬藍耳病與副豬嗜血桿菌病混合感染。進一步對該場的免疫情況以及飼養環境進行了調查，發現該場的免疫水平較低，飼養環境條件較差，通風不好，并且飼養密度大，潮濕，糞便清理不及時。飼料堆積處通風條件差，這些可能是造成了該場疫病發生的主要原因。因此該場應及時做好豬藍耳病等相關疫病免疫接種，改善飼養環境。副豬嗜血桿菌屬于豬體內常在菌，當豬免疫力低下時，中等毒力、強毒株就會產生致病作用。該病發病呈現出季節性，一般秋冬季高發。經常和其他病原體混合感染，例如與豬繁殖和呼吸綜合征病毒、豬流感病毒和豬呼吸道冠狀病毒、鏈球菌、支原體等[12]。本研究通過PCR檢測、細菌分離及生化試驗鑒定到導致該例發病豬死亡的病原包含副豬嗜血桿菌，藥敏試驗結果顯示分離鑒定的副豬嗜血桿菌對頭孢噻呋、羧芐西林、頭孢唑啉、氟苯尼考高度敏感；對洛美沙星、慶大霉素、氧氟沙星、新霉素、環丙沙星中毒敏感；對林可霉素不敏感。該結果為防治本豬場的副豬嗜血桿菌提供科學用藥依據。目前，防控豬藍耳病和副豬嗜血桿菌病的有效手段還是有針對性接種流行病毒株和菌株血清型相匹配的疫苗，定期監測抗體水平，合理制定免疫程序，并結合健全的生物安全綜合措施，因此，建議飼養場根據診斷結果，合理選擇疫苗、定期開展相關監測、科學制定免疫程序，并注重飼養環境的生物安全。

4 結論

通過臨床癥狀，病理解剖，實驗室診斷確定該豬場發生了經典豬藍耳病及副豬嗜血桿菌病混合感染。

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[4]郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS流產胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病，1996，2：1-5.

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[12]Kavanová L,Prodělalová J,Nedbalcová K,et al.Immune response of porcine alveolar macrop-hages to a concurrent infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Haemophilus parasuis in vitro[J].Veterinary Microbiology,2015,180(1-2):28-35.