QHF復方對人肝癌Huh7細胞生長、侵襲及腫瘤干細胞表面標志物表達的影響

劉丹，焦良波，張文，王心怡，陳濤，胡衛，*

（1．三峽大學醫學院國家中醫藥管理局中藥藥理/腫瘤科研三級實驗室，湖北宜昌443002；2．三峽大學附屬第二人民醫院，湖北宜昌443002；3．宜昌市第二人民醫院，湖北宜昌443002）

原發性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，雖然近年來各種療法層出不窮，但由于肝癌的高轉移和復發率，其5年生存率極低[1]。腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)學說認為 ， CSCs是導致腫瘤復發、轉移及耐藥性的關鍵所在[2-3]。因此，針對腫瘤干細胞的治療有望成為根除肝癌的有效治療方法之一。近年來中醫藥以其獨特的辨證論治理論和“治未病”的防治特點，在控制腫瘤轉移方面已凸顯其優勢[4]。本課題組前期研究發現中藥QHF復方能抑制肝癌細胞的增殖，并能明顯抑制肝癌的轉移和復發[5]，但對于QHF復方抑制肝癌細胞生長的機制尚不清楚，故本實驗將在細胞水平上探討QHF復方對Huh7細胞生長、凋亡、侵襲及肝癌干細胞表面標記物的影響，以期為探討QHF復方防治肝癌提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人肝癌Huh7細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院。華蟾素注射液購自安徽金蟾生化股份有限公司；人參皂苷Rg3標準品和胰蛋白酶均購自上海源葉生物科技有限公司；香菇多糖購自南京澤朗植提技術有限公司；注射用血塞通(凍干)購自昆明制藥集團股份有限公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 QHF復方配制參考文獻[5]，將華蟾素、人參皂苷Rg3、三七總皂苷、香菇多糖按一定的比例進行配制。

1.2.2 細胞增殖實驗分為溶劑對照組(細胞培養孔內加入不含血清的DMEM高糖培養基)、陽性對照組[加入2.5μg/mL順鉑(DDP，用不含血清的DMEM培養基配制)]和QHF復方處理的實驗組，實驗組每孔分別加入不同濃度(20、40、80、160、320μg/mL，用不含血清的DMEM培養基配制)的QHF復方懸液100μL，培養24、48、72h，藥物作用終止前4h，于每孔中各加入5 mg/mLMTT20μL，繼續培養4h后，吸棄孔內培養基，每孔加入150μL DMSO，搖床上振蕩10min，使紫色結晶充分溶解。于酶標儀上檢測各孔 光 密度D(570)值。按下式計算藥物對腫瘤細胞的增殖抑制率。

細胞增殖抑制率=[溶劑對照組 D (570)值-實驗組 D (570)值]/[溶劑對照組 D(570)值-空白組 D(570)值]×100%

1.2.3 細胞侵襲實驗溶劑對照組與陽性對照組給藥方法同前，實驗組選用QHF 復方的80μg/mL用于后續實驗。取饑餓4h的對數生長期細胞，用含0.2%胎牛血清蛋白(BSA)的無血清DMEM 培養基重懸細胞，取100 μL(7×104/mL)細胞懸液加入Transwell小室的上室中，各組加藥100μL。下室中加入600μL含10%B S A的DMEM高糖培養基，24h后，吸棄小室內的培養基，用棉簽輕輕擦去膜內表面的細胞，4%多聚甲醛固定1h，結晶紫染色30min，清水沖洗，揭下濾膜，放在載玻片上于200倍光鏡下觀察濾膜外的細胞，隨機選擇5個視野進行細胞計數，計算平均值。

1.2.4 細胞周期檢測實驗分組及給藥劑量同1.2.3。取生長相近并處于對數生長期的細胞，各組細胞給藥培養48h后，胰酶消化制成單細胞懸液，離心棄上清，PBS洗滌并用冰乙醇固定后用預冷的PBS漂洗離心，使用10μL RNA酶(10g/L)處理后，加入熒光染料溴化丙錠溶液490μL，避光染色30min，300目尼龍膜過濾后采用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5 細胞凋亡檢測細胞分組及前期處理同1.2.4，各組細胞給藥培養48h后，用不含EDTA的胰酶消化制成單細胞懸液，離心棄上清，加入100μL結合緩沖液和FITC標記的Annexin-V(20μg/mL)10μL，室溫避光30 min，再加入PI(50μg/mL)5μL，避光反應5min后，加入400μL結合緩沖液，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 細胞表面標志物CD133和CD44的檢測細胞分組及前期處理同1.2.4，各組細胞給藥培養48h后，胰酶消化制成單細胞懸液，離心后棄上清，80μL PBS懸浮，加入藻紅蛋白(PE)標記的抗體10μL，室溫暗處孵育30min。加FcR阻斷劑20μL，緩沖液80μL，充分混合后避光，4℃放置10min，PBS洗滌，重懸，離心去上清，加500μL PBS重懸細胞，上機分析細胞表面標記物CD133和CD44的表達情況。

1.3 統計學方法

實驗重復3次， 采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。以α =0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 QHF復方對Huh7細胞增殖的影響

與DDP組比較，不同濃度(20、40、80、160和320 μg/mL)QHF復方在各時間點均能抑制Huh7細胞增殖，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，但抑制作用均低于DDP組(P均<0.05)。見表1。根據QHF復方對肝癌Huh7細胞抑制作用具有時間和劑量依賴性，且在QHF為 8 0μg/mL時，作用效率更強，故選用QHF復方的80 μg/mL用于后續實驗。

表1 QHF 復 方對人肝癌細胞系Huh7細胞增殖抑制率的影響(%，-x±s)

2.2 QHF復方對Huh7細胞侵襲的影響

80μg/mL QHF組和DDP組(陽性對照組)穿透濾膜進入下室的Huh7細胞數目均低于溶劑對照組，且QHF組細胞數目低于DDP組，差異均具有統計學意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 QHF 復 方對人肝癌 H uh7細胞侵襲能力的影響

2.3 QHF復方對Huh7細胞周期的影響

與溶劑對照組比較，陽性對照DDP組和80μg/mL QHF組G0/G1期的細胞比例均減少，S期的比例均增加，DDP組G2/M期的細胞比例明顯增多而QHF組G2/M期的比例減少，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見 圖 2 和表2。

圖2 QHF復方對人肝癌細胞系Huh7細胞周期的影響

表2 QHF復方對人肝癌細胞系 H uh7細胞周期的影響(%，-x±s)

2.4 QHF復方對Huh7細胞凋亡的影響

與溶劑對照組比較，QHF組和DDP組凋亡細胞比例明顯增高，且QHF組細胞凋亡比例明顯高于DDP組，差異均具有統計學意義(P均<0.05)。見圖3和表3。

2.5 QHF復方對Huh7細胞表面標志物CD133和CD44表達的影響

流式細胞術檢測結果見表 3，QHF組表達CD133+和CD44+細胞比例較溶劑對照組明顯降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)；陽性對照DDP組表達CD133+和CD44+細胞比例與溶劑對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 QHF復方對人肝癌細胞系Huh7細胞凋亡的影響

表3 QH-F 復 方對人肝癌細胞系 H uh7 細 胞凋亡率和 C D133、 C D44表達的影響(x± s)

3 討論

CSCs在腫瘤的發生、發展和放化療抗性中發揮著十分重要的作用。Reya等[6]提出的“腫瘤干細胞學說”認為：在腫瘤組織中存在一種數量較少的干細胞樣癌細胞亞群，具有癌細胞和干細胞的特性，是腫瘤形成的起始細胞，在腫瘤形成、生長和轉移中起決定作用，這種細胞稱為腫瘤干細胞。隨后的研究表明肝癌中也存在肝癌干細胞(liver cancer stem cells，LCSCs)，而且肝癌的高復發和高轉移性與LCSCs有關[7-8]。目前發現CSCs表面標記物有CD133、CD24、CD44、CD166和EpCAM等，其中CD133、CD44是最常見的標記物[9-10]。CD133是一種跨膜糖蛋白，是經典的CSCs標志分子，表達CD133+的肝細胞具有腫瘤干細胞的特征：即高克隆性、成瘤性及對放化療的抗性[11]。另有研究顯示，肝癌術后復發、預后不良與CD133+細胞表達密切相關[12]。Song等[13]實驗研究也證實CD133在肝癌治療中發揮核心作用。CD44是一種細胞表面蛋白，最先被認為是淋巴細胞受體[14]，也是透明質酸的主要表面受體[15]，不少研究結果顯示CD44能調節或加強抗凋亡蛋白作用而在CSCs中具有重要意義[16]。

課題組前期實驗發現QHF復方能顯著提高肝癌H22荷瘤小鼠的生存期[17]，可抑制肝癌HepG2細胞遷移、侵襲能力及血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達[18]，但對于該復方是否是通過下調肝癌干細胞表面標記物的表達來發揮抗肝癌作用的尚不清楚。因此本實驗選用高表達CD133的人肝癌Huh7細胞[13，19]為研究對象，初步探討QHF復方對肝癌干細胞的影響。結果顯示，QHF復方能抑制人肝癌Huh7細胞的增殖、侵襲，使細胞周期阻滯在S期，并促進Huh7細胞的凋亡，顯著下調肝癌干細胞表面標記物CD133和CD44的表達，使CD133+和CD44+細胞比例明顯降低。這些結果提示QHF復方能夠影響人肝癌Huh7細胞周期、促進細胞凋亡，從而抑制細胞的生長、侵襲，這種抑制作用可能是由于QHF復方對腫瘤干細胞具有抑制作用，但是也不排除腫瘤干細胞分化成了其他細胞，或者只是抑制了CD133和CD44的表達。因此，下一步擬分離出CD133+和CD44+肝癌干細胞，進一步研究該復方對干細胞活性(如增殖、耐藥、體內成瘤等方面)的影響，探究QHF復方可能的抗肝癌干細胞的作用機制。

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