高壓氧輔助抗蛇毒血清治療對(duì)五步蛇毒中毒大鼠腎保護(hù)作用研究*

賀東坡，謝智慧，喻安永,李 沫

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院:1.急診科;2.高壓氧科，貴州遵義 563000)

五步蛇又稱(chēng)尖吻蝮蛇，在我國(guó)主要分布于南方，蛇毒含血循環(huán)毒素、酶類(lèi)及少量神經(jīng)毒素等。被咬傷后可出現(xiàn)患者肢體腫脹、腎功能受損、急性化膿性感染甚至彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)危及生命。毒蛇咬傷后約1/3的毒素經(jīng)腎臟排泄。因此，蛇咬傷后需注重腎功能的影響。高壓氧(HBO)可使血氧含量增加、增加局部病變的供氧、通過(guò)抑制炎性介質(zhì)的釋放減輕炎癥反應(yīng)，而蛇咬傷后腎臟處于缺血、缺氧狀態(tài)、炎性介質(zhì)大量合成和釋放、過(guò)多活性氧自由基產(chǎn)生，理論上通過(guò)HBO的治療可改善腎損傷。故本實(shí)驗(yàn)擬在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)研究五步蛇咬傷后大鼠腎損傷的變化，以及蛇咬傷后在抗蛇毒血清治療的同時(shí)給予HBO輔助治療，進(jìn)一步探討HBO的輔助治療對(duì)五步蛇中毒大鼠腎保護(hù)的作用，為HBO輔助治療毒蛇咬傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性SD大鼠96只，體質(zhì)量(250.00±20.00)g，分批購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試劑：五步蛇蛇毒，購(gòu)買(mǎi)自安徽黃山祁門(mén)蛇傷研究所。

1.2方法

1.2.1靜脈注射五步蛇蛇毒致大鼠腎損傷模型的建立 參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-3]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用稀釋好的五步蛇蛇毒[(半數(shù)致死量)LD50=1.594 mg/kg]，在大鼠的尾部消毒后從尾靜脈注射五步蛇毒，劑量為鼠0.8×LD50，以生理鹽水溶解成1.594 mg/mL的濃度注射，根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算出注射劑量。如大鼠注射蛇毒后出現(xiàn)立毛、喜靜少動(dòng)、食欲食量差、體質(zhì)量下降、耳郭周邊有散在的出血點(diǎn)、血尿、大小便失禁等即可判斷造模成功。在造模的過(guò)程中出現(xiàn)動(dòng)物死亡，或未達(dá)到中毒模型標(biāo)準(zhǔn)的予以剔除，再重新補(bǔ)充SD大鼠，重新造模。

1.2.2動(dòng)物分組 將健康成年雄性SD大鼠96只分為對(duì)照組(A組)、蛇毒中毒組(B組)、血清治療組(C組)、血清聯(lián)合HBO治療組(D組)，每組24只。B、C、D組大鼠經(jīng)尾靜脈注射五步蛇蛇毒建立中毒模型，C組于建模成功后即從尾靜脈注射抗蛇毒血清，D組于注射抗蛇毒血清后0、4、11、23 h將動(dòng)物置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用HBO艙(型號(hào)JB150-98)內(nèi)，加壓5 min至0.12 MPa，同時(shí)純氧洗艙，之后5 min加至0.2 MPa，穩(wěn)壓吸氧40 min，減壓10 min，艙內(nèi)氧濃度保持在95%以上；A組不予任何處理。

1.2.3血清肌酐(Cr)、凝血功能檢測(cè) 將A、B、C、D組分別于模型建立后1、5、12、24 h分別取3只大鼠用10%水合氯醛經(jīng)腹腔充分麻醉，乙醇消毒、備皮、鋪巾，無(wú)菌剪自腹中線(xiàn)自下而上逐層打開(kāi)腹腔、移開(kāi)腸管、找到腹主動(dòng)脈，用一次性注射器抽出5 mL血后用止血鉗夾閉腹主動(dòng)脈，將抽出的血3 mL注入生化管，待其凝固后在4 ℃以3 000 r/min離心15 min，取上清液400 μL送化驗(yàn)室檢測(cè)Cr。剩余2 mL注入加有枸櫞酸鈉的EP管中，在4 ℃以3 000 r/min離心15 min，用于檢測(cè)凝血功能，包括活化部分凝血活酶(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和纖維蛋白原(FIB)。

1.2.4病理學(xué)觀察 A、B、C、D組分別于模型建立后1、5、12、24 h分別取3只大鼠先用生理鹽水經(jīng)左心室灌注，待灌注液清亮后，再加入多聚甲醛繼續(xù)灌注從而固定腎組織，并取右腎上極實(shí)質(zhì)部分行HE染色光鏡下觀察病理變化。

2 結(jié) 果

2.1五步蛇毒中毒模型建立成功后一般表現(xiàn) 中毒后大鼠表現(xiàn)出立毛、喜靜少動(dòng)、食欲食量差、體質(zhì)量下降、耳郭周邊有散在的出血點(diǎn)、血尿、大小便失禁，肉眼觀察腎臟出現(xiàn)明顯的充血情況。

2.2各組大鼠腎組織病理改變 B組大鼠出現(xiàn)腎小球出血、腎小囊擴(kuò)張，周?chē)?xì)血管充血，腎小管擴(kuò)張，可見(jiàn)細(xì)胞低平，刷狀緣脫落，腎小管上皮細(xì)胞空泡化，腎間質(zhì)組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。隨著中毒時(shí)間的延長(zhǎng)腎出血減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加。C組治療后1 h大鼠腎小球圓形，鰻氏囊壁狹窄，腎小管上皮細(xì)胞空泡化及脫落細(xì)胞，小管周?chē)谐鲅組治療后1 h大鼠腎小球圓稍充血，腎小管上皮細(xì)胞空泡化及脫落細(xì)胞減輕，小管周?chē)倭砍鲅組大鼠中毒5 h后腎小球橢圓形略充血，腎小管略擴(kuò)張，小管周?chē)谐鲅車(chē)醒仔约?xì)胞浸潤(rùn)。C組治療5 h后大鼠腎小球圓形周?chē)倭砍溲獗硪?guī)整，腎小管周?chē)鲅獪p少，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小囊無(wú)擴(kuò)張。D組治療5 h后大鼠腎小球橢圓形周?chē)溲獪p少，外表規(guī)整，腎小管周?chē)鲅獪p少，有炎性滲出，腎小囊無(wú)擴(kuò)張，見(jiàn)圖1。

2.3各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)Cr水平比較 與A組比較，B組各時(shí)間點(diǎn)的血Cr水平明顯升高(P<0.05)。與B組比較，C、D組在治療1 h后血Cr水平明顯降低(P<0.05)，且D組血Cr水平明顯低于C組(P<0.05)，見(jiàn)表1

2.4各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)凝血功能比較 與A組比較，B組各時(shí)間點(diǎn)的APTT、PT均明顯升高(P<0.05)。與B組比較，C、D組APTT水平均明顯降低。在注毒1、5 h后D組APTT水平又明顯低于C組(P<0.05)。C、D組PT水平各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與A組比較，B組FIB于注毒后1 h明顯降低(P<0.05)，予以血清、血清+HBO治療后明顯上調(diào)，但C、D組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2～4。

A：B組中毒1 h；B：C組治療1 h；C：D組治療1 h；D：B組中毒5 h；E：C組治療5 h；F：D組治療5 h

圖1 B、C、D組大鼠不同時(shí)間腎臟病理學(xué)改變

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)Cr水平比較

a：P<0.05,與同時(shí)點(diǎn)A組比較；b：P<0.05,與同時(shí)點(diǎn)B組比較；c：P<0.05，與同時(shí)點(diǎn)C組比較

表2 各組大鼠APTT水平比較

a：P<0.05,與同時(shí)點(diǎn)A組比較；b：P<0.05，與同時(shí)點(diǎn)B組比較；c：P<0.05，與同時(shí)點(diǎn)C組比較

表3 各組大鼠PT水平比較

a：P<0.05,與同時(shí)點(diǎn)A組比較；b：P<0.05，與同時(shí)點(diǎn)B組比較

組別1 h5 h12 h24 hA組1.70±0.301.70±0.301.70±0.301.70±0.30B組0.20±0.10a1.20±0.802.50±1.201.40±0.90C組1.50±0.60b1.70±0.502.50±1.402.10±0.80D組1.70±0.60b1.20±0.202.50±0.403.0±0.30

a：P<0.05,與同時(shí)點(diǎn)A組比較；b：P<0.05，與同時(shí)點(diǎn)B組比較

3 討 論

五步蛇屬血循環(huán)類(lèi)毒蛇，蛇毒含血循毒素、酶類(lèi)及少量神經(jīng)毒素等[4-5]。被咬傷后可出現(xiàn)患者肢體腫脹、腎功能受損、急性化膿性感染甚至DIC危及生命。因腎臟是蛇毒排泄的重要途徑之一，腎損傷是五步蛇咬傷常見(jiàn)的并發(fā)癥[6-9]，因此，保護(hù)腎臟尤為重要。

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，目前比較認(rèn)同的毒蛇咬傷導(dǎo)致腎功能異常具體機(jī)制有以下幾種：(1)毒蛇咬傷后腎臟出現(xiàn)缺血、缺氧，炎癥細(xì)胞被激活、炎癥介質(zhì)的合成和釋放[10]。蛇咬傷后有大量炎癥細(xì)胞侵入后引起的腎臟病理改變[11]，PETRICEVICH等[12]通過(guò)靜脈給小鼠注射蝮蛇蛇毒，在小鼠的血清中檢測(cè)到血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)均有所升高。(2)蛇毒中毒后機(jī)體內(nèi)生成活性氧自由基增多。(3)蛇毒對(duì)紅細(xì)胞有溶解作用，其釋放出的血紅蛋白可引起腎小管的栓塞，從而導(dǎo)致腎損傷。(4)機(jī)體凝血系統(tǒng)被毒素破壞，導(dǎo)致凝血異常，引起腎出血。(5)活化磷脂酶A(PLA)，活化后的PLA形成的卵磷脂可引起血管內(nèi)的溶血[13-14]， COSTA等[15]證實(shí)蛇毒中的PLA-2可升高人體血清TNF-α、IL-1。(6)類(lèi)組胺的作用，蛇毒進(jìn)入血液循環(huán)直接干擾類(lèi)組胺的釋放和循環(huán)，可導(dǎo)致腎血流量的減少，腎小管收縮，腎小球?yàn)V過(guò)率(GRF)下降，最終引起腎功能的損傷。(7)腎小管上皮細(xì)胞直接受損。(8)橫紋肌的溶解。總之，以上各因素最終導(dǎo)致腎血流量減少，腎小管收縮而使腎臟缺血缺氧，從而引起腎損傷。

近年來(lái)HBO作為腎損傷的輔助治療已成為一個(gè)熱點(diǎn)研究，并被大家逐漸認(rèn)可。其主要作用機(jī)制有以下幾方面：(1)通過(guò)HBO治療，可以增加血氧含量、提高血氧分壓、使血氧彌散距離增加，從而改善病變部位的氧供；(2)改善組織微循環(huán)障礙；(3)抗氧化性損傷，HBO的治療在一定程度上增加了機(jī)體的抗氧化能力，使受損組織氧化損傷減少；(4)抑制炎性介質(zhì)的釋放、減輕炎癥反應(yīng)；(5)加快組織損傷的自我修復(fù)。本課題組前期研究已證實(shí)，HBO可以通過(guò)減少TNF-α的生成和抗組織脂質(zhì)過(guò)氧化，從而減輕腎缺血再灌注損傷(IRI)及發(fā)揮保護(hù)腎功能的作用[5]。

抗蛇毒血清在蛇咬傷中的治療作用仍為首選治療，也是目前對(duì)毒蛇咬傷最有效的治療，且其治療時(shí)間越早越好。但關(guān)于HBO輔助抗蛇毒血清治療五步蛇咬傷的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道甚少。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)靜脈注射五步蛇毒的中毒大鼠中出現(xiàn)血尿，肉眼觀察到中毒大鼠腎臟有明顯水腫、充血。腎HE染色觀察，注毒后1 h的B組中可看到有腎小球的出血，腎小管上皮細(xì)胞空泡化、上皮刷狀緣脫落，管腔內(nèi)的出血，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)等。以上表現(xiàn)提示通過(guò)靜脈注射五步蛇毒可造成腎臟損傷。而蛇毒中毒后的大鼠在通過(guò)抗蛇毒血清治療(C、D組)后的1、5 h腎損傷的程度逐漸減輕，腎小球表現(xiàn)為圓形，外表規(guī)整，腎小管的擴(kuò)張程度、空泡化及脫落細(xì)胞較B組減輕，但在注毒后12、24 h時(shí)腎出血的程度及浸潤(rùn)炎性細(xì)胞數(shù)量的多少改善不明顯。D組各時(shí)間點(diǎn)腎損傷的程度較C組減輕更明顯，其腎小球表現(xiàn)為圓形，外表規(guī)整，腎小管出血的程度及炎癥浸潤(rùn)的面積減少，以上結(jié)果表示，HBO早期干預(yù)對(duì)五步蛇毒中毒大鼠腎損傷有保護(hù)作用。

血Cr水平可反映腎小球的濾過(guò)功能，在被五步蛇咬傷中毒后，可引起GRF的下降，因此測(cè)定Cr水平對(duì)于評(píng)估蛇傷后腎損傷的嚴(yán)重程度有一定指導(dǎo)意義。與A組比較，B、C、D組各時(shí)間點(diǎn)的血Cr水平明顯升高(P<0.05)。與B組比較，C、D組在1 h 血Cr水平明顯降低(P<0.05)，但在5 h之后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示注毒1 h后中毒大鼠的腎功能出現(xiàn)了異常，并在經(jīng)抗蛇毒血清治療后得到了改善，5 h之后再進(jìn)行治療效果不明顯。D組血Cr水平在1 h也明顯低于C組(P<0.05)，5 h之后B、C、D組Cr水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示抗蛇毒血清聯(lián)合HBO治療效果優(yōu)于單純使用抗蛇毒血清，且越早使用HBO治療效果越好。

在凝血功能方面，B組各時(shí)間點(diǎn)的APTT值與A組相同時(shí)間點(diǎn)比較均明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)APTT值雖有下降趨勢(shì)，但與A組比較仍明顯升高(P<0.05)。B組各時(shí)間點(diǎn)PT值與A組相同時(shí)間點(diǎn)比較均明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，而其他各組各時(shí)間點(diǎn)間數(shù)值的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組的FIB數(shù)值在1 h明顯低于A組(P<0.05)，而隨時(shí)間延長(zhǎng)，注射毒素后5 h其值逐漸變?yōu)檎＃黄渌鹘M各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示在五步蛇毒中毒后會(huì)引起機(jī)體FIB大量破壞，進(jìn)一步發(fā)生凝血系統(tǒng)破壞，影響血液凝固，促進(jìn)出血的發(fā)生，最終導(dǎo)致凝血功能的異常。血清治療后APTT值較治療前有下降趨勢(shì)(P<0.05)，雖然PT、FIB改善不明顯，但仍提示抗蛇毒血清治療有臨床意義。經(jīng)血清聯(lián)合HBO治療后，APTT值下降趨勢(shì)較單純血清治療改善更明顯(P<0.05)，特別是注射毒素5 h之內(nèi)，這提示HBO治療可改善凝血功能，且越早干預(yù)機(jī)體預(yù)后越佳。凝血功能變化與血Cr水平的變化同步，均為在1 h時(shí)血清聯(lián)合HBO治療效果最明顯。提示監(jiān)測(cè)凝血功能的變化對(duì)于判斷腎功能變化有一定的意義。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在大鼠五步蛇毒中毒模型建立成功的基礎(chǔ)上，通過(guò)腎臟病理變化的觀察，檢測(cè)腎功能、凝血功能指標(biāo)，進(jìn)一步來(lái)探討血清聯(lián)合HBO治療效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HBO輔助抗蛇毒血清治療對(duì)五步蛇毒中毒大鼠腎損傷的恢復(fù)起到了積極的作用，治療時(shí)間越早效果越明顯。對(duì)臨床中出現(xiàn)的腎損傷，HBO的輔助治療有望成為一種新的治療手段。

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