滋腎育胎丸對DOR大鼠模型Bcl-2、Bax表達的影響*

陳 思，樊耀華，李 婧，趙 穎，張芝桐，黎子瑩，陳穎慧

(1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院婦產科，廣州 510405)

卵巢產生成熟卵子的數量減少，或卵泡質量下降，均將導致婦女生育能力下降及性激素失調，稱為卵巢儲備功能下降(diminished ovarian reserve,DOR)，臨床表現為月經量少、閉經、排卵障礙、不孕等，同時臨床中以血清基礎卵泡雌激素(bFSH) <40 IU/L，結合B超及其他血清學檢查評估輔助診斷DOR；若其進一步發展可導致卵巢功能衰竭，給患者的生活及工作帶來巨大影響[1-4]。中醫學中雖未有DOR的病名記錄，但根據臨床表現，可歸于月經過少、月經后期、閉經、不孕、年未老水斷等病證中。現代中醫認為腎在DOR的發病中起到了至關重要的作用，因此在治療上均提倡以補腎為主。滋腎育胎丸為羅元愷教授之經驗方，具有補腎健脾、益氣養血之功，基于“腎主生殖”的原理，抓住其補腎以調經、助孕、安胎的主線，在臨床上也被用于治療DOR[4]，但關于其治療機制的研究較少，因此本研究將通過探討滋腎育胎丸對DOR大鼠模型的卵泡、卵泡間質Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，探討其治療DOR的機制，為滋腎育胎丸進一步在臨床上推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD大鼠60只，體質量175 g左右，由廣東省醫學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(粵)2013-0002。實驗動物質量合格證明編號：44007200027926。對購入動物檢疫3 d，期間每天檢查動物1次，未發現不健康動物，則全部納入實驗。觀察大鼠動情周期，篩選50只有規律動情周期的大鼠進行下一步實驗。

1.1.2藥物與試劑 滋腎育胎丸(批號：V0043)，購自廣州白云中一藥業有限公司；補佳樂(批號：20150415)，購自拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司；雷公藤多甙片(批號：20150404)，購自遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司；Bcl-2 rabbit polyclonal IgG：Santa Cruz Biotechnology,Inc.Lot No.:G2516；Bax rabbit polyclonal IgG：Santa Cruz Biotechnology,Inc.Lot No.:F3016；羧甲基纖維素鈉(批號：20150119)，購自天津市大茂化學試劑廠。

1.1.3實驗儀器 Leica TP1020 脫水機，Leica EG1140H 包埋機，Leica RM2255切片機，Leica Autostainer XL染色機購自徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司)，奧林巴斯IX71倒置顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司。

1.2方法

1.2.1試劑劑量設計 雷公藤多甙片劑量為55 mg/kg，每天灌胃1次；滋腎育胎丸低劑量為0.79 g/kg，每天灌胃1次；高劑量為3.15 g/kg，每天灌胃2次；陽性藥補佳樂劑量為0.30 mg/kg，每天灌胃1次。

1.2.2試劑配備 (1)0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液：取4/5總配置量的純凈水至燒杯中，準確稱量CMC-Na，磁力攪拌器邊加熱邊攪拌下緩慢加入燒杯中，攪拌至完全溶解，放入2～8 ℃冰箱過夜，第2天定容至所需量即可。(2)雷公藤多甙片混懸液：取70片雷公藤多甙片，研磨粉碎后，加4.90 g吐溫80，攪拌均有后，加純凈水至127 mL，攪拌溶解即可。(3)滋腎育胎丸：將滋腎育胎丸研磨后加入0.5%CMC-Na溶液研磨攪拌均勻，使其分別為7.90%(m∶v)及15.75%(m∶v)兩個濃度。(4)補佳樂：將補佳樂加入0.5%CMC-Na溶液研磨攪拌均勻使其濃度為0.03 mg/mL。

1.2.3DOR模型制備 選取動情周期規律的大鼠40只，其中8只作為對照組，給予0.10 mL/kg的0.5%CMC-Na溶液灌胃，每天1次，連續14 d。余下的32只大鼠，按0.10 mL/kg體質量的劑量灌胃雷公藤多甙片溶液制作DOR模型，每天1次，連續14 d。自灌胃造模后第4～14天，每天進行陰道涂片，觀察動情周期。

1.2.4分組及給藥 將DOR模型制作成功的動情周期紊亂大鼠32只，隨機分為模型組、補佳樂組及滋腎育胎丸低、高劑量組(低、高劑量治療組)，每組8只。補佳樂組按0.10 mL/kg體質量灌胃補佳樂溶液作為陽性對照；低、高劑量治療組按0.10 mL/kg體質量灌胃相應濃度的滋腎育胎丸溶液，低劑量治療組1次/天，高劑量治療組2次/天；模型組和對照組給予等量的0.5%CMC-Na溶液，1次/天，連續35 d。

1.2.5卵巢內卵泡計數 末次給藥24 h內，取大鼠的卵巢組織，進行石蠟包埋，切片。病理切片為連續5 μm切片，每間隔9張取1張切片進行HE染色，觀察卵巢組織變化并計算各類卵泡數。觀察1個卵巢，卵泡中見卵丘、卵泡腔者稱為大卵泡(竇狀卵泡或成熟卵泡)，卵泡中未見卵丘及明顯卵泡腔者稱為小卵泡(竇前卵泡或始基卵泡)，卵泡的形態不規則，卵母細胞表現為核偏位、固縮、透明帶塌陷，顆粒細胞及卵泡膜細胞松散、萎縮并脫落入卵泡腔稱為卵泡閉鎖。累積計算可得大卵泡、小卵泡及閉鎖卵泡的數量。

1.2.6卵巢Bcl-2、Bax蛋白表達的檢測 采用免疫組織化學法檢測各組大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax蛋白的表達。經抗原修復(微波法)、封閉內源性過氧化物酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復染、脫水透明、封片。置于普通顯微鏡400倍數下觀察拍片，每個標本挑選大、小、閉鎖卵泡及卵巢間質各3個區域進行拍片。運用Image-Pro Plus 5.1圖像處理系統，對圖片進行分析，測定并記錄每張圖片的平均面積、平均光密度值，計算出累積光密度值(IOD)。

2 結 果

2.1各組大鼠卵巢組織形態比較 對照組大鼠卵巢皮質部有數個卵泡，處于不同發育階段，以小卵泡為主；原始卵泡位于皮質深層，間質未見炎性細胞浸潤。模型組大鼠卵巢萎縮，卵泡數量較少，卵巢皮質部有數個卵泡，處于不同發育階段，以閉鎖卵泡為主，卵泡顆粒細胞層次減少，間隙增大；間質見不同程度的炎性細胞浸潤。高劑量治療組大鼠卵巢較對照組小，卵巢皮質部有數個卵泡，數量較對照組少，處于不同發育階段，以小卵泡為主；間質見少量炎性細胞浸潤。低劑量治療組大鼠卵巢較對照組少，卵巢皮質部有數個卵泡，處于不同發育階段，數量較對照組少，以小卵泡為主；卵泡顆粒細胞層次減少，間隙增大；間質見少量炎性細胞浸潤。補佳樂組大鼠卵巢較對照組少，卵巢皮質部有數個卵泡，處于不同發育階段，以小卵泡為主，間質未見炎性細胞浸潤。各組大鼠卵巢組織病理形態，見圖1。

圖1各組大鼠卵巢組織病理形態(×100)

2.2各組大鼠卵巢卵泡計數比較 與對照組比較，模型組大鼠小卵泡、大卵泡數量減少，且其閉鎖卵泡數量增加，差異均有統計學意義(P<0.01)；高劑量治療組大鼠小卵泡、大卵泡數量及閉鎖卵泡數量與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；低劑量治療組、補佳樂組的小卵泡數量明顯低于對照組(P<0.05)，大卵泡數量及閉鎖卵泡數量與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，高劑量治療組、低劑量治療組、補佳樂組的小卵泡、大卵泡均明顯增加，閉鎖卵泡數量明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3各組大鼠卵巢Bcl-2蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠的大卵泡、小卵泡及閉鎖卵泡的Bcl-2蛋白表達均降低(P<0.05)，卵巢間質的Bcl-2表達也略有降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，高劑量組治療、低劑量治療組、補佳樂組的大卵泡及小卵泡的Bcl-2蛋白表達均明顯升高(P<0.05)，閉鎖卵泡和卵巢間質的Bcl-2表達也略有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。低、高劑量治療組大鼠大卵泡及小卵泡的Bcl-2蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 各組大鼠卵巢卵泡計數比較

a：P<0.01,b：P<0.05,與模型組比較；c：P<0.05,與對照組比較

2.4各組大鼠卵巢Bax蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組的大卵泡、小卵泡及閉鎖卵泡中的Bax表達水平均明顯上升(P<0.05)，卵巢間質的Bax表達水平也略有上升，但差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，高劑量治療組、低劑量治療組、補佳樂組大鼠的大卵泡、小卵泡及閉鎖卵泡Bax表達水平有明顯降低(P<0.05)，卵巢間質中的Bax表達水平也略有降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 各組大鼠卵巢Bcl-2蛋白表達水平比較

a：P<0.05，與模型組比較

表3 各組大鼠卵巢Bax蛋白表達水平比較

a：P<0.05，與模型組比較

3 討 論

流行學研究發現，DOR在人群中的發生率約為10%，一般需要1～6年發展為卵巢早衰(POF)，嚴重影響女性的身心健康[1-2]。由于DOR的發病是多因素綜合作用的結果，其具體發病機制尚不明確，因此臨床上亟須發現更有效、不良反應小的治療方法改善卵巢儲備功能，提高女性的生育能力，調節女性的性激素水平。中醫學認為腎在DOR中起到了至關重要的作用[5-6]。《素問·上古天真論》曰：“女子……二七天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子……七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也。”闡釋了腎藏精氣為化血之源，為婦女的月事、胎孕提供物質基礎。因此腎中精氣是否充足，直接影響到婦女經血及胎產情況。適孕婦女出現卵巢功能低下等不孕的癥狀，也須從腎之精氣虧虛來考慮。

滋腎育胎丸是全國著名中醫學家羅元愷的經驗方，由廣州白云中一藥業集團生產，由黨參、白術、巴戟天、何首烏、杜仲、續斷、菟絲子、熟地黃等組成，具有補腎健脾、益氣培元、養血安胎的功能，基于“腎主生殖”的原理，嶺南羅氏婦科流派抓住以補腎調經、助孕、安胎的主線，在臨床上不僅應用自然流產的防治，也用于月經不調、不孕癥、未破裂卵泡黃素化綜合征、卵巢損傷、先兆流產等治療，提高體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率，以及用于POF和DOR的治療[7-11]。

正常的細胞凋亡在機體生長發育及維持內環境穩定等方面發揮重要作用，凋亡過度或不足均會導致不同類型的疾病。Bcl-2是B細胞濾泡性淋巴瘤染色體斷裂點發現的凋亡抑制基因。而Bax則是Bcl-2家族中研究最為廣泛的促凋亡基因，在凋亡過程中起著樞紐作用[6]。女性從胎兒至青春期，卵母細胞不斷減少，在此過程中，大量卵泡發生凋亡，以確保最終有適量優質卵泡維護卵巢功能[12]，目前發現尤其是Bcl-2和Bax的表達對卵泡在生長發育有重要作用。卵泡在生長發育過程中的大量丟失與Bax的持續表達相關，而當卵泡需要進一步增殖時，Bcl-2選擇性表達，可與Bax互相調節，使卵巢儲備維持在合理水平[13-15]。然而，當Bcl-2與Bax表達失調時，在發育過程中的卵泡開始凋亡，形成閉鎖卵泡，最終導致DOR[16]。

本研究發現，與對照組比較，模型組的大卵泡、小卵泡計數下降，閉鎖卵泡數量增加，各類卵泡的Bcl-2表達降低，Bax表達上升，提示雷公藤多甙可影響卵巢各類卵泡Bcl-2及Bax的表達，一方面導致小卵泡(竇前卵泡或始基卵泡)不能發育為大卵泡(竇狀卵泡或成熟卵泡)或誘導小卵泡形成閉鎖卵泡，成熟卵泡數量下降；另一方面導致大卵泡凋亡加速，成熟卵泡質量下降，共同促進DOR的發生與發展。與模型組比較，高劑量治療組、低劑量治療組、補佳樂組大鼠的大卵泡、小卵泡數量明顯增加(P<0.05)，閉鎖卵泡數量明顯減少(P<0.01)，且使大、小卵泡的Bcl-2表達水平均明顯升高(P<0.05)，Bax表達水平均明顯下降(P<0.05)。提示滋腎育胎丸可通過上調Bcl-2表達水平，下調Bax表達水平，從而促進DOR模型大鼠的卵巢卵泡發育生長。但與模型組比較，高劑量治療組、低劑量治療組、補佳樂組的閉鎖卵泡Bcl-2表達均增加，但差異無統計學意義(P>0.05)，而其Bax表達均下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。提示滋腎育胎丸可能通過調控Bcl-2家族其他抑制凋亡的基因作用于閉鎖卵泡，需進一步研究探討。

在滋腎育胎丸治療中，高劑量治療組大鼠的大卵泡、小卵泡計數增加明顯。但在大卵泡、小卵泡的Bcl-2及Bax表達水平中，高、低劑量無明顯線性關系，其原因可在日后的研究中進一步探究，可能與滋腎育胎丸的有效濃度相關。在高劑量治療組、低劑量治療組、補佳樂組中，補佳樂組的小卵泡Bcl-2表達水平最高，Bax表達水平最低；但在卵泡計數方面，高劑量治療組的小卵泡計數最高，閉鎖卵泡計數最少，這提示滋腎育胎丸除通過調節Bcl-2、Bax表達水平外，還可通過其他治療機制多靶點、高效性地治療DOR，有待進一步研究闡明。

綜上所述，滋腎育胎丸使DOR模型大鼠Bcl-2表達水平上升，Bax表達水平下降，抑制卵泡過早、過快地凋亡，促進卵巢中的卵泡生長發育，恢復卵巢各類卵泡數量，從而改善卵巢儲備功能，該過程是其治療DOR的機制之一。因此，滋腎育胎丸是治療DOR具有良好前景的藥物，需深入研究其治療DOR的機制，有利于其在臨床上進一步推廣，為DOR的防治奠定有效的基礎。

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