大鼠腦創傷對學習記憶及海馬環磷腺苷反應元件結合蛋白的影響*

熊 翺，金 戈，李利鋒，吳 雙，熊仁平，魯 宏△

(1．鄭州大學臨床醫學系 450001；2.鄭州大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室 450001；3.重慶市第七人民醫院放射科 400054；4.陸軍軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所/創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室分子生物學中心，重慶 400042)

腦創傷早期的病理改變主要是腦水腫，創傷后6 h明顯，12 h達到峰值，維持至24 h，隨著創傷時間的延長，腦損傷往往變得錯綜復雜，使之成為不可逆性損傷[1-2]。創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)恢復后出現以認知功能障礙為主要特征的神經功能異常，而已知環磷腺苷反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)通過CREB 133位磷酸化(p-CREB),活化CREB，翻譯各種神經活性蛋白，最終增強學習記憶功能[3-7]。因此，本實驗通過測定腦創傷早期的腦含水量、CREB及p-CREB水平，探討腦創傷及其p-CREB水平的改變，對學習記憶的影響。

1 材料與方法

1.1材料 動物：Wistar大鼠54只，購于重慶市陸軍軍醫大學野戰外科研究所實驗動物中心[動物生產許可證號：SCXK(渝)2012-0005；動物使用許可證號：SYXK(渝)2012-0010)]，健康成年雄性，體質量220～250 g。主要試劑及儀器：兔抗CREB單克隆抗體(abcam公司,ab32515,美國)，兔抗p-CREB(ser133)單克隆抗體(Thermo公司,PA1-4619,美國)，山羊抗GAPDH多克隆抗體(Santa cruz公司,sc-20357,美國)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和檢測系統(Bio-Rad公司,美國)；PinPointTM顱腦撞擊儀(Hatteras公司,美國)，掃描分析軟件系統(LabworksTM Analysis Software，美國)。

1.2方法

1.2.1動物分組 將54只大鼠采用隨機數字表法分為正常組、對照組、TBI組。每組18只，用于腦海馬組織CREB和CREB的133位絲氨酸磷酸化[(p-CREB(ser133)]水平檢測(n=6)、腦含水量測定(n=6)和Morris水迷宮實驗(n=6)。

1.2.2動物模型的建立 借鑒FEENEY等[8]的成熟技術方法,依據本課題前期實驗結果的撞擊參數[9]，用PinPointTM顱腦損傷撞擊器建立中度TBI動物模型。對照組開骨窗后不進行打擊致傷其余處理同TBI組。正常組不開骨窗不進行打擊致傷其余處理同TBI組。

1.2.3腦含水量測定 采用干濕質量法[10]，TBI后12 h麻醉，斷頭處死，開顱取大鼠腦組織，用濾紙吸盡表面血漬后，置于已烤干并稱質量的錫紙上，稱濕質量后置于85 ℃恒溫干燥箱內干燥72 h 至恒質量，再稱干質量后按Elliot公式計算腦含水量：

腦含水量(ω)=(濕質量-干質量)/濕質量×100%

1.2.4Morris水迷宮實驗 TBI前，隨機選擇1個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，3次分別從3個象限(目標象限除外)的入水點入水，直至大鼠入水后能夠找到平臺。歷時3 d，第1天讓大鼠自由游泳2 min；從第2天起，每天訓練3次，每次間隔1 h；第4天開始如下實驗：(1)潛伏期(定位航行實驗，反映空間記憶的獲得和參照物記憶能力)，即大鼠由入水到爬上隱匿平臺的時間(s)。如果大鼠在120 s內未找到平臺，將其引至平臺上放置20 s，這時潛伏期記為120 s。(2)尋求正確次數(空間搜索實驗，檢測空間記憶的保持和工作記憶能力)，撤去原有平臺，即大鼠2 min內經過原平臺上方水域的次數。(3)TBI后7 d，重復以上實驗，訓練3 d，第11天開始實驗。

1.2.5Western blot檢測CREB和p-CREB(ser133)表達 TBI后12 h，取大鼠傷側海馬組織，參照文獻[11]的方法，分別在盛有液氮的研缽中研粹，置于0.4 mL含蛋白酶抑制劑的組織裂解液(RIPA)中，提取蛋白并定量。電泳后進行海馬組織CREB和p-CREB(ser133)水平測定。GAPDH抗體滴度1∶200；CREB和p-CREB(ser133)抗體滴度1∶800。掃描分析軟件系統掃描X射線光片目的條帶，進行密度分析,結果用灰階×面積表示灰度值。校正上樣量采取目的蛋白的灰度值與GAPDH內參蛋白的灰度值相比取其比值的方法，目的蛋白與內參蛋白的比值，進行歸一。

2 結 果

2.1各組大鼠腦含水量比較 正常組、對照組、TBI組大鼠腦創傷12 h腦組織含水量分別為(75.15±0.12)%、(76.29±0.14)%、( 84.81±0.47)%，與正常組和對照組比較，TBI組明顯升高(P<0.01)。

2.2各組大鼠Morris水迷宮潛伏期及尋求正確次數比較 各組大鼠腦創傷前學習記憶比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與正常組和對照組比較，TBI組大鼠腦創傷后11 d潛伏期增加，2 min內尋求正確次數減少，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 腦創傷前后各組大鼠學習記憶情況比較

a：P<0.01，b：P<0.05，與TBI組比較

圖1 CREB和p-CREB(ser133)在大鼠海馬組織的表達

2.3各組大鼠CREB和p-CREB(ser133)蛋白表達水平比較 與正常組比較，對照組大鼠CREB和p-CREB(ser133)蛋白的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；TBI組大鼠CREB和p-CREB(ser133)蛋白的表達水平均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1、表2。

表2 CREB和p-CREB(ser133)蛋白在各組大鼠海馬組織的相對表達量比較

a：P<0.01，與TBI組比較

3 討 論

TBI隨著交通事故和意外傷害的增加而增加，即使得到救治，生存的患者也可能發展成慢性創傷性腦病(chronic traumatic encephalopathy，CTE)，表現為以認知功能障礙為主的神經功能異常。認知障礙是TBI最具代表性的后遺癥，著重表現為學習記憶損害。本研究檢測到腦創傷后，大鼠腦組織含水量明顯增多，腦水腫明顯。水迷宮實驗，腦創傷大鼠潛伏期增加，2 min內尋求正確次數減少，大鼠空間記憶的獲得和保持能力、參照物記憶能力和工作記憶能力減弱，說明TBI減弱了大鼠的學習記憶能力。

CREB的活化是通過CREB 133位磷酸化完成，翻譯各種神經活性蛋白，最終增強學習記憶功能[4]。本研究檢測到TBI大鼠海馬組織不但CREB蛋白水平明顯降低，而且p-CREB(ser133)水平也下降。CREB的活化減少，這使其在負責的生物學功能啟動中，很難發揮作用。p-CREB(ser133)下降，甚至功能失活，不能完成啟動多種基因的轉錄，影響細胞內多種長期生物學效應，可能使依賴p-CREB 通路誘導下游基因表達的記憶功能受損。有研究發現，p-CREB介導的轉錄，還可以促使新的突觸鏈接的生成，提高神經元的存活率，緩解腦損傷后認知障礙[12]。海馬是腦創傷易損區，且與認知功能有關，它的損傷可導致學習機功能障礙[3.13-14]，觀察腦創傷后海馬部位的CREB及p-CREB水平，可以從一個側面反應動物的學習記憶能力，結合本次動物行為學實驗結果，腦創傷后空間記憶的獲得和保持能力、參照物記憶能力和工作記憶能力都減弱。為了緩解和治療腦損傷后認知障礙，臨床治療的新思路可能是刺激CREB 的表達和促使p-CREB(ser133)發生。

綜上所述，腦創傷后學習記憶功能受損。要緩解腦創傷后的認知功能障礙，需要標本兼治腦水腫，活化有利于記憶儲存的分子(CREB和p-CREB)，進而激活細胞內蛋白激酶級聯反應，誘導靶細胞基因表達而引發學習記憶突觸水平的長時程增強(LTP)[15]，改善腦損傷后認知功能。

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