植物乳桿菌和干酪乳桿菌的抗氧化活性研究

胡姝敏，劉寶華，孫欣瑤，李曉東，李東花

（1.黑龍江龍丹乳業科技股份有限公司，哈爾濱150010；2.東北農業大學食品學院，哈爾濱150030)

0 引言

益生菌為適當量服用時對宿主健康有益的活體微生物制劑，具有降低血清膽固醇和抗氧化等生理功能。氧化是導致某些疾病的根本原因[1-4]，引起氧化的主要因素則是自由基[5]。如果能夠消除過多的氧化自由基，相關疾病便能得到預防[6]。研究表明，益生菌具有一定的抗氧化能力，能夠清除腸道內的活性氧分子，使機體內活性氧分子保持在相對穩定的狀態[7-9]。

干酪獨特的理化特性,使其成為了益生菌的良好載體[10]。而 Lucía Abadía-García等人[11]研究表明益生菌能夠提高農家干酪的抗氧化性。目前商業上應用的最廣泛的益生菌為乳桿菌屬[12]。所以本論文首先研究植物乳桿菌KLDS1.0202和干酪乳桿菌KLDS1.0319自身的抗氧化性情況，然后確定其在干酪中的抗氧化能力，為功能性食品的研究和開發提供理論依據。

1 實驗

1.1 材料

植物乳桿菌KLDS1.0202；干酪乳桿菌KLDS1.0319，商業發酵菌種Lactococcus lactissubsp.C remoris和Lactococcus lactissubsp.lactis混合菌種，鐵氰化鉀，三氯乙酸，三氯化鐵，DPPH，1,10-鄰二氮菲，硫酸亞鐵，雙氧水。

M RS培養基：酪蛋白消化物10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏10.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，磷酸氫二鉀2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.08 g。

M RS固體培養基：在上述M RS液體培養基中加入1.5%的瓊脂。

1.2 儀器與設備

JD 500-2電子天平，VD-1320超凈工作臺，DH 5000A電熱恒溫培養箱，SYQ-DSX-280B手提式蒸汽滅菌鍋，U LTRA-TURRAX T 8均質機，數顯恒溫水浴箱，JY-92-ⅡN超聲波細胞粉碎機，離心機，GL-20G-Ⅱ冷凍離心機，UT-1800紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與保存

植物乳桿菌和干酪乳桿菌作為益生菌采用MRS培養基進行培養。將MRS培養基于121℃滅菌15 m in，于37℃培養24 h，反復傳代至菌株的活菌數在1.0×108m L-1以上，將菌液與50%滅菌甘油按2∶3混合，于-20℃凍存備用。

1.3.2 植物乳桿菌和干酪乳桿菌抗氧化活性的測定

根據Lee及宋曉辰等人的方法[13,14]。將篩選得到的乳酸菌株活化，傳代3次后，2%接種于M RS液體培養基，37℃培養24 h，培養液經轉速為4 000 r/m in，4℃離心10m in，收集菌體沉淀，經無菌去離子水洗滌兩次.將上述進行一次，收集菌體。將菌體使用生理鹽水調整OD600=1.0。所得菌懸液分為4組：1組作為活細胞組；2組，在冰浴條件下使用超聲波粉碎儀進行粉碎，300W條件下，每處理5 s，間隔5 s，持續25m in，顯微鏡下檢查沒有完整細胞后，在溫度為4℃轉速為8 000 r/m in下，離心15 m in，收集上清液，即為無細胞提取物；3組，在溫度為37℃下，培養20 m in，然后在4℃轉速為5 000 r/m in，離心15 m in，收集上清液，即為胞外分泌物組；4組，在100℃條件下加熱處理30m in，即為菌體滅活組。

1.3.2.1 菌株清除DPPH自由基能力的測定

細胞破碎液離心后取上清液1.0 m L，加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH·甲醇溶液1 m L，混勻后在室溫下避光反應30m in，離心后取上清液在517 nm下測定光密度值，按照下式計算菌株清除DPPH自由基的能力，以PBS緩沖液作空白對照。

DPPH自由基清除率=[1-A 517(樣品)/A 517(空白)]×100%。

1.3.2.2 菌株清除羥自由基(·OH)能力的測定

0.1 m L的EDTA，0.01m L的FeC l3，0.1 m L的H2O2，0.36m L的脫氧核糖，0.33m L的PBS，0.1m L的抗壞血酸混合液中加入1 m L細胞破碎后的上清液，然后在37℃水浴1 h，水浴完成后向混合液中加入TBA和TCA顯色，形成的粉紅色物質在532 nm測光密度值，按照下式計算清除羥自由基的能力，以PBS緩沖液作空白對照。

羥自由基清除率=[1-A532(樣品)/A532(空白)]×100%。

1.3.2.3 菌株還原能力的測定

反應液中菌0.5m L，鐵氰化鉀（質量分數1%）0.5m L和磷酸鹽緩沖液（PBS濃度為0.2 mol/L，pH＝6.6）0.5 m L混合在50℃水浴20 m in，反應后冷卻并加入0.5 m L三氯乙酸（TCA質量分數1%）沉淀蛋白。離心后取1 m L上清液與1 m L氯化鐵（質量分數0.1%）反應，于700 nm下測吸光度，其中L-半胱氨酸作為標品。

1.3.3 益生菌契達干酪的制作

原料乳→標準化→巴氏殺菌（63℃，30m in）→冷卻（32℃）→添加發酵劑和益生菌→發酵（30℃，1 h）→添加CaC l2→添加凝乳酶（0.003%）→凝乳（31℃，1 h）→切割（1 cm3）→攪拌升溫至42℃（每3～5 m in升高1℃）→保溫攪拌（45 m in）→靜置（30 m in）→排乳清→凝塊堆砌（每15 m in反轉堆積1次，反轉7次）→破碎與加鹽→成型壓榨→包裝、8℃成熟。

1.3.4 益生菌契達干酪抗氧化活性

共4組契達干酪，其中空白組（Batch-1）：只添加2%商業發酵劑。實驗組：Batch-2為添加質量分數為2%商業發酵劑和1.2%植物乳桿菌；Batch-3為添加質量分數為2%商業發酵劑和1.2%干酪乳桿菌；Batch-4為添加質量分數為2%商業發酵劑、0.6%植物乳桿菌和0.6%干酪乳桿菌。以清除DPPH自由基、還原力和清除羥自由基為指標，分別測定4種契達干酪的抗氧化活性。

1.3.4.1 組成成分

總蛋白質的測定方法根據GB5009.5-2010；

脂肪測定方法根據GB 5413.3-2010；

水分測定根據GB 5009.3-2010中方法；

氯化鈉質量分數的測定參照GB/T 12457-2008中方法。

pH值測定：干酪與去離子水在無菌條件下以1∶2的比例均勻混合，用pH計直接測定。

1.3.4.2 水溶性提取物的制備

根據Kuchroo&Fox[15]的方法制備水溶性提取物（W SE）。30 g干酪加90 m L 50 mm o l/L磷酸鹽緩沖液，并在勻漿器中勻漿10 m in。懸浮液在40℃下利用均質機濾紙過濾。提取液溫和攪拌1 h（150 r/m in），然后在4℃，3 000 g下離心30 m in。懸浮液通過W hatm an no.2濾紙過濾，提取液用1 m o l的HC l調pH值到4.6，水溶性提取物冷凍干燥并在-18℃下保存使用。

15 m g凍干樣品加1 m L蒸餾水用于還原力分析，50 m g凍干樣品加1 m L蒸餾水用于DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力分析。

1.3.4.3 水溶性提取物抗氧化性的測定

（1）DPPH自由基清除能力的測定。根據Shim ada等人[16]的方法進行測定。0.1 m L（質量濃度50 m g/m L）水溶性提取物（W SE）樣品與3.9 m L新制備的60 μm ol/L DPPH-甲醇溶液混合，45 m in后，用紫外可見分光光度計在517 nm下測其吸收值，并用蒸餾水代替樣品作空白。

（2）還原力的測定。水溶性提取物的還原力根據Duh等人[17]的方法進行測定。2.5 m L（質量濃度15 m g/m L）樣品加入2.5m L濃度為0.2mol/L（pH＝6.6）磷酸鹽緩沖液，再加入2.5 m L質量濃度為10 m g/m L鐵氰化鉀溶液，混合物在50℃下放20 m in，然后加入2.5 m L質量濃度為 100 g/L三氯乙酸（TCA），在3 000 g下離心10 m in。2.5 m L上清液加入2.5 m L蒸餾水和0.5m L三氯化鐵（質量濃度1mg/m L），在700 nm下測吸光值。反應物吸光值越高，還原能力越強。用和樣品相同濃度的BHT做空白。

（3）羥自由基清除能力的測定。根據Liu等人[18]的方法進行測定。1 m L濃度為0.75mmol/L的1,10-鄰二氮菲，1 m L濃度為0.75mm ol/L的FeSO4，1m L的H2O2（體積分數0.01%）,1.5 m L（0.15 m o l，pH＝7.4）磷酸鹽緩沖液混合，產生羥自由基，再加入1m L樣品溶液，在37℃下培養30 m in。在536nm下測混合物的吸光值。

式中：A0為代替H2O2和提取物的去離子水的吸光值；A樣為提取液存在時的吸光值；A空為沒有提取液的吸光值。

1.4 數據統計分析

每個實驗重復3次，結果表示為平均數(M ean)±SD。數據統計分析采用Statistix 8.1(分析軟件，St Pau l,M N)軟件包中Linear M odels程序進行，差異顯著性(P＜0.05)分析使用Tukey HSD程序。采用Sigm aplot11.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌和干酪乳桿菌抗氧化活性的測定

將乳酸菌的四種處理成分，包括活細胞(1組)、無細胞提取物（2組）、胞外分泌物（3組）、滅活的菌體（4組），采用DPPH方法、羥自由基清除及還原能力的方法，進行抗氧化性的評價。

2.1.1 DPPH自由基清除能力的測定

由圖1可以看出，植物乳桿菌與干酪乳桿菌對DPPH自由基的清除能力比較強。DPPH自由基是一種以氮為中心、比較穩定、靈敏的自由基，廣泛地用于評價物質的抗氧化活性。自由基清除劑可與其單電子配對，致使其本身深紫色逐漸消失或減弱，其褪色程度與抗氧化物質呈現定量關系。無論是植物乳桿菌還是干酪乳桿菌，其2組的無細胞提取物對DPPH的清除能力最強，分別為53.86%和51.96%。然后是胞外分泌物，其次是菌體滅活組，菌體活細胞組對DPPH的清除能力最弱。由圖看出，植物乳桿菌對DPPH的清除能力均比干酪乳桿菌強。而無論是無論是哪一組，植物乳桿菌的DPPH自由基清除能力都高于干酪乳桿菌。

2.1.2 羥自由基清除能力的測定

圖1 植物乳桿菌與干酪乳桿菌的DPPH自由基的清除能力

由圖2可以看出，植物乳桿菌與干酪乳桿菌對羥基的清除能力各有差異。·OH是體內氧化性很強的自由基。病理實驗中，常研究·OH的清除作用揭示某些病變原因、衰老機理。2組的無細胞提取物對·OH的清除能力最強，分別為13.03%和10.89%。然后是菌體活細胞組，其次是胞外分泌物，菌體滅活組對·OH的清除能力最弱。

圖2 植物乳桿菌與干酪乳桿菌的羥自由基清除能力

2.1.3 還原能力的測定

由圖3可以看出，植物乳桿菌與干酪乳桿菌對鐵離子的還原力各有差異。良好的電子供體不僅能使Fe3+還原成Fe2+，從而使吸光值上升；同時能與自由基反應，使自由基成為較為穩定的物質，從而中斷自由基連鎖反應，其反應產物在700 nm處吸光度越大表明樣品的還原力越強。而良好的電子供體是還原能力強的物質。無論是菌體滅活組、胞外分泌物還是菌體活細胞組，植物乳桿菌的還原力都大于干酪乳桿菌，但是干酪乳桿菌的無細胞提取物的還原能力大于植物乳桿菌，并且兩種菌株的無細胞提取物的還原能力在所有分組中最強，分別為0.257和0.305。

圖3 植物乳桿菌與干酪乳桿菌的還原能力

2.2 益生菌契達干酪抗氧化活性

2.2.1 益生菌契達干酪組成成分

干酪產品的成分主要受原料乳的成分和性質以及生產過程的差異這兩方面因素的影響。標準契達干酪的組成成分如下：蛋白質20%～30%，脂肪20%～34%，鹽1%～3%，pH值4.7～5.3。由表1所知，4種契達干酪樣品組成成分的質量分數值均處于文獻中標準文獻契達干酪的組成成分含量范圍之內。并從表中可以看出，4種契達干酪的組成成分之間并無顯著性差異（P＞0.05），說明益生菌的添加對干酪組成成分沒有顯著的影響，以下抗氧化活性測定的實驗可以進行。

表1 契達干酪在8℃下成熟24周后組成成分分析結果 %

2.2.2 水溶性提取物抗氧化性的測定

2.2.2.1 DPPH自由基清除能力的測定

由圖4可以看出，4種干酪在24周的成熟過程中，DPPH自由基的清除能力先增加后減小，并在16周左右達到最大值，添加益生菌的干酪分別為47.30%，48.65%，51.72%；顯著高于空白組的45.05%(P＜0.05)。這是由于干酪在成熟過程中，蛋白質會發生降解反應，生成一些小分子肽，這些肽中有些具有一定的抗氧化性，并且隨著成熟時間的加長，還會形成一些具有抗氧化性的氨基酸，這些物質都會增加契達干酪的抗氧化性。在16周之后，蛋白質降解的速度變得緩慢，生成的具有抗氧化性的肽類物質又會降解成一些不具有抗氧化性的氨基酸，所以在第20周和24周抗氧化性有所降低。乳桿菌已經被證明具有產生二肽酶、羧肽酶、三肽酶、氨肽酶和肽鏈內切酶的能力[15]，由此可知在四種干酪樣品中，加入植物乳桿菌和干酪乳桿菌的契達干酪的DPPH自由基清除能力顯著高于空白組(P＜0.05)。

圖4 契達干酪水溶性提取物的DPPH自由基的清除能力

2.2.2.2 還原力的測定

由圖5可以看出，四種干酪樣品的還原能力在20周前都會隨著成熟時間的增加而增大，尤其在12～20周增長的較為顯著(P＜0.05)，并在第20周達到最大值，分別為0.366，0.479，0.515，0.656；而在20周以后有所下降。而加入菌的干酪的還原能力顯著高于空白組干酪樣品的還原性(P＜0.05)，而加入兩種益生菌的干酪的還原力最大。反應產物在700 nm處吸光度越大表明樣品的還原力越強，抗氧化性也就越強，所以結果表明空白組契達干酪抗氧化活性較其他三種切達干酪最低。這是因為契達干酪在成熟期間蛋白質會發生降解生成小分子物質肽、氨基酸等，在成熟前期蛋白質降解生成的物質的分子量要比后期的分子量大，還原性顯著低于后期生成的氨基酸等小分子量的物質，這與K.H.Sabeena Farvin[16]研究的結果相似。他證明＞30 ku和在10～30 ku之間的大分子片段的還原能力明顯低于抗壞血酸，相反，小于3 ku的低分子物質的還原能力要高于抗壞血酸。所以分子量月底的物質片段的還原性越強，抗氧化性也就越強。

圖5 契達干酪水溶性提取物的還原力

2.2.2.3 羥自由基清除能力的測定

由圖6可以看出，契達干酪的羥自由基清除能力隨著成熟時間的延長而增加，尤其在8～16周增長速度較快，并在第16周左右分別達到最大值43.86%，46.19%，46.66%和47.43%；在第20和24周有所下降。這是由于加入了益生菌作為抗氧化劑與羥自由基發生了反應，阻止了羥自由基與蛋白質結合，從而蛋白質發生降解產生抗氧化肽，使得契達干酪具有抗氧化性。加入了益生菌的契達干酪的羥自由基的抑制能力明顯高于未加入益生菌的契達干酪的羥自由基的抑制能力(P＜0.05)，而加入植物乳桿菌和干酪乳桿菌的羥自由基的抑制能力沒有明顯的差別(P＞0.05)，加入混合益生菌的契達干酪要稍高于其他切達干酪。

圖6 契達干酪水溶性提取物的羥自由基清除能力

由以上可知，在8℃成熟時，分別加入植物乳桿菌、干酪乳桿菌和同時加入兩種益生菌干酪的DPPH自由基清除能力及羥自由基清除能力均在第16周達到最大值，而還原力在第20周達到最大值，且均顯著高于空白組(P＜0.05)，表明兩種菌能夠顯著提高干酪的抗氧化活性。

3 結論

植物乳桿菌KLDS1.0202和干酪乳桿菌KLDS1.0319自身都有一定的抗氧化活性，而且通過試驗發現，對于兩種菌株來說，無細胞提取物的DPPH自由基和羥自由基的清除能力以及還原能力都是最強的。對于無細胞提取物來說，植物乳桿菌KLDS1.0202的DPPH自由基清除和羥自由基清除能力略高于干酪乳桿菌KLDS1.0319，而干酪乳桿菌KLDS1.0319的還原能力高于植物乳桿菌KLDS1.0202，表明不同的評價方法會產生不同的結果。同時也發現，植物乳桿菌和干酪乳桿菌添加到契達干酪中能夠提高干酪在成熟過程的抗氧化活性，與空白組契達干酪相比，分別加入植物乳桿菌KLDS1.0202、干酪乳桿菌KLDS1.0319和同時加入兩種益生菌干酪的DPPH自由基清除能力、還原力和羥自由基清除能力都有顯著的提高（P＜0.05），DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力在第16周達到最大值，分別為47.30%，46.19%；48.65%，46.66%和51.72%，47.43%；還原力在第20周達到最大值，分別為0.479和0.515、0.656。添加益生菌的干酪在組成成分上與空白干酪相比并無顯著差異（P＞0.05）。以上表明兩種菌不僅自身具有一定的抗氧化活性，還能促進干酪蛋白質的分解，提高干酪的抗氧化活性。

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