鵝掌柴蜂蜜的糖類指紋圖譜構(gòu)建及摻假識(shí)別研究

林丹，馮志強(qiáng)，莊俊鈺，陳曉嘉，侯真真，黃柳霞

（1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州510308；2.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510308；3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站，廣東廣州510308）

鵝掌柴蜂蜜，是南方特有冬季蜜種，故俗稱“冬蜜”。鵝掌柴也叫鴨腳木、文母樹，原產(chǎn)中國臺(tái)灣、福建、云南、貴州、四川、西藏、廣東、海南等地，一般用它的根和皮曬干為藥。鵝掌柴蜂蜜色澤為淺琥珀色，較易結(jié)晶，質(zhì)地優(yōu)良，味甘而略帶特有苦味。除具有蜂蜜之清熱、補(bǔ)中、解毒、潤燥等功效外，還有發(fā)汗解表、祛風(fēng)除濕之功效，對(duì)感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛有較好輔助療效[1-3]。鵝掌柴蜂蜜的藥用功能正逐步引起人們的重視。

由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，蜂蜜摻假現(xiàn)象對(duì)蜂蜜的質(zhì)量和銷售市場帶來嚴(yán)重的問題。最初蜂蜜摻假原料主要是水、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖、飴糖、羧甲基纖維素、糊精或淀粉類物質(zhì)。但是，用這些物質(zhì)摻假得到的蜂蜜較易辨別，因此現(xiàn)在很少使用，取而代之的是用葡萄糖、果糖、蔗糖、高果玉米糖漿、甜菜糖漿、甘蔗糖漿、果葡糖漿等摻假。葡萄糖和果糖為天然蜂蜜主要成分，蜂蜜國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定蜂蜜中葡萄糖和果糖含量在60%以上，因此這些物質(zhì)的加入不但沒有破壞蜂蜜的風(fēng)味，還使它們的指標(biāo)值得到了加強(qiáng)。隨著各種合成色素、蜂蜜香精和工業(yè)淀粉酶的使用，不法分子更是以水、葡萄糖、果糖、工業(yè)糖漿和工業(yè)淀粉酶為原料，以蜂蜜國家標(biāo)準(zhǔn)為技術(shù)參考，通過加入色素和蜂蜜香精來制造全假蜂蜜，蒙騙消費(fèi)者，獲取暴利[4-7]。假蜂蜜盡管在技術(shù)指標(biāo)上符合國家標(biāo)準(zhǔn)，但它不具天然蜂蜜的全部營養(yǎng)成分，更不具有天然蜂蜜獨(dú)特的保健功能。

糖類是蜂蜜的主要的成分，其中單糖中的葡萄糖和果糖占蜂蜜總糖的55%～75%，而雙糖和三糖的含量因蜜源種類的不同而變化。蜂蜜指紋圖譜具有整體性和可以部分量化的特征。每種蜂蜜都有獨(dú)特的區(qū)別于其他種類的化學(xué)組分，即有它們白己的指紋特征[8]。本研究通過測定鵝掌柴蜂蜜的糖類指紋圖譜，找出鵝掌柴蜂蜜的分布規(guī)律，為鵝掌柴蜂蜜的定性鑒別奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取流通領(lǐng)域上具有代表性的鵝掌柴蜂蜜樣品4個(gè)，常見的摻假物質(zhì)有果葡糖漿、玉米糖漿和麥芽糖漿，自制摻假樣品20個(gè)。

果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，純度≥99%：Sigma公司；乙腈（色譜純）：Honeywell公司。

糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液（20 mg/mL）：分別吸取經(jīng)過（96±2）℃干燥2 h的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖各1 g，加水定容于50 mL，置于4℃密封可貯藏一個(gè)月。

糖標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別吸取糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00、2.00、3.00、5.00 mL于10 mL容量瓶、加水定容，分別相當(dāng)于 2.0、4.0、6.0、10.0 mg/mL 濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 設(shè)備與儀器

Agilent1200高效液相色譜儀帶發(fā)光散射檢測器ELSD：安捷倫公司；氨基柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）：安捷倫公司；AG 204天平：瑞士METTLER公司；KQ5200DE型超聲波儀：昆山市超聲儀器在限公司；JB-1磁力攪拌器：上海雷磁·創(chuàng)益儀器儀表有限公司；CF15RXⅡ高速冷凍落地式離心機(jī)：日本日立制作所。

1.3 試樣的制備和保存

未結(jié)晶的樣品將其用力攪拌均勻；有結(jié)晶析出的樣品，可將樣品瓶蓋塞緊后置于不超過60℃的水浴中溫?zé)幔龢悠啡咳诨螅瑪噭颍杆倮鋮s至室溫以備檢測用。在融化時(shí)應(yīng)該注意防止水分侵入。蜂蜜等易變質(zhì)試樣置于0℃～4℃保存。

動(dòng)態(tài)謂詞邏輯(DPL)為一階邏輯的“動(dòng)態(tài)化”，這就是為什么自然語言通常采用一階公式表達(dá)實(shí)踐知識(shí)的語言形式的原因。

1.4 樣品處理

稱取均勻后的試樣1 g～2 g（精確到0.000 1 g）于50 mL容量瓶，加水定容至50 mL，充分搖勻，用于干燥濾紙過濾，棄去初濾液，后續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾或離心獲取上清液過0.45 μm微孔濾膜至樣品瓶，供液相色譜分析。

1.5 色譜條件

a）流動(dòng)相：乙腈+水=70+30（體積比）；b）流速：1.0 mL/min；c）柱溫：40 ℃；d）進(jìn)樣量：20 μL；e）漂移管溫度：80℃。

1.6 樣品測定

將試樣溶液注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查的試樣中的糖濃度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

計(jì)算數(shù)據(jù)庫的描述統(tǒng)計(jì)量并對(duì)其進(jìn)行分析。

利用Sufer軟件繪制摻假物質(zhì)糖類的等值線圖，并對(duì)圖譜進(jìn)行分析。

采用夾角余弦法計(jì)算鵝掌柴蜂蜜與常見摻假物質(zhì)、摻假蜂蜜糖類指紋圖譜的相似度，同時(shí)比較各類樣品相似度的差異。相似度（夾角余弦）的計(jì)算公式如下：

式中：Xi為某樣品組分i的含量；Yi為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜組分i的含量；n為某樣品標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中所有組分的數(shù)目，i為樣品中的某一組分。

2 結(jié)果與討論

2.1 鵝掌柴蜂蜜與常見鑒別摻假物質(zhì)、摻假蜂蜜的糖類組成

從表1數(shù)據(jù)可知，鵝掌柴蜂蜜中的果糖含量高達(dá)40 g/100 g以上，玉米糖漿和麥芽糖漿中的果糖含量均為未檢出；葡萄糖含量明顯低于果葡糖漿、高于玉米糖漿；麥芽糖含量明顯低于玉米糖漿和麥芽糖漿。從表2數(shù)據(jù)可知，對(duì)比鵝掌柴蜂蜜樣品，摻假樣品中的果糖、葡萄糖和麥芽糖的含量均有變化，因此可以通過分析樣品中的糖類變化鑒別鵝掌柴蜂蜜的真?zhèn)巍?/p>

表1 鵝掌柴蜂蜜與常見摻假物質(zhì)的糖類組成Table 1 Carbohydrate composition of schefflera honey and adulterated material

表2 摻假鵝掌柴蜂蜜的糖類組成Table 2 Carbohydrate composition of adulterated honey

2.2 單一物質(zhì)摻假蜂蜜的糖類分析

根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，以摻假物質(zhì)量為橫坐標(biāo)，果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖作為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖見圖1。

圖1 摻假鵝掌柴蜂蜜糖類變化規(guī)律Fig.1 Carbohydrate composition change of adulterated honey

由圖1可知，當(dāng)摻假物質(zhì)為果葡糖漿時(shí)，葡萄糖、果糖和蔗糖的變化不太明顯，摻假后的樣品中的麥芽糖均為未檢出；當(dāng)摻假物質(zhì)為玉米糖漿和麥芽糖漿時(shí)，果糖和葡萄糖的含量隨著摻假量的增加而減少，麥芽糖含量隨著摻假量的增加而增加，蔗糖含量均為未檢出。

標(biāo)準(zhǔn)差是最常用及最重要的離散趨勢統(tǒng)計(jì)量，當(dāng)數(shù)字差別顯示越大時(shí)，可以標(biāo)示為變量間的差異越大。對(duì)鵝掌柴蜂蜜和各類摻假蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差分析，見表3。

表3 鵝掌材蜂蜜及摻假樣品的標(biāo)準(zhǔn)差分析Table 3 Standard deviation of schefflera honey and adulteration

從表3中標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)據(jù)可知，摻假蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)差排序是果糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖，其中果糖的值最大，其值為12.11，其次為麥芽糖，其值為12.06。果糖和麥芽糖的變化最為明顯。

圖2 摻假物質(zhì)與果糖、麥芽糖的等值線圖Fig.2 Isogram of fructose and maltose in adulteration

2.3 鵝掌柴蜂蜜摻假的等值分布

對(duì)試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)差比較大的兩種糖類進(jìn)行交互試驗(yàn)，建立2種糖類與摻假含量的等值線圖。以果糖的含量為X軸，麥芽糖的含量為Y軸，繪制出與果葡糖漿、玉米糖漿、麥芽糖漿摻假量的等值線圖，圖中所取等值點(diǎn) 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 表示為摻假物質(zhì)在樣品中的含量，見圖2。

從圖2直觀顯示出，玉米糖漿、麥芽糖漿在圖中的分布具有明顯的梯度變化，玉米糖漿，當(dāng)獲取某摻假待測樣品中果糖和麥芽糖的值時(shí)，通過確定該值在圖中的坐標(biāo)點(diǎn)，可辨別出待測樣品中摻假物質(zhì)的含量大小。但該方法對(duì)于鵝掌柴蜂蜜中摻假果葡糖漿的鑒別不具有明顯的鑒別效果。

2.4 鵝掌柴蜂蜜及摻假樣品的相似度分析

以鵝掌柴蜂蜜樣品1為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，通過夾角余弦法計(jì)算出摻假物質(zhì)和摻假蜂蜜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜之間的相似度，見表4。

表4 各類樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度比較Table 4 Similarity of samples and standard fingerprint

從表4可知，摻假物質(zhì)與鵝掌柴蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，果葡糖漿的相似度為0.990 1，玉米糖漿和麥芽糖漿的相似度比較低，分別為0.109 5和0.241 7。單一摻假蜂蜜中，5%～50%果葡糖漿摻假蜂蜜的相似度范圍為0.983 5～0.996 5，5%～50%玉米糖漿摻假的相似度范圍為0.733 7～0.991 5，5%～50%麥芽糖漿摻假蜂蜜的相似度范圍為0.781 7～0.993 9；混合摻假蜂蜜中，樣品的相似度均低于0.99。鵝掌柴蜂蜜的相似度均大于0.999，說明標(biāo)準(zhǔn)糖類指紋圖譜能夠反映鵝掌柴蜂蜜的共同特性，同時(shí)也能夠反映摻假蜂蜜與鵝掌柴蜂蜜之間的差異。

2.5 鵝掌柴蜂蜜特征指紋圖譜的建立

計(jì)算出鵝掌柴蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量的抽樣誤差，通過公式計(jì)算出特征糖類的置信區(qū)間端點(diǎn)，得出鵝掌柴蜂蜜中各個(gè)特征糖類的99%置信區(qū)間，見表5。

表5 鵝掌材蜂蜜各種糖類含量的范圍Table 5 Carbohydrate content of schefflera honey

鵝掌柴蜂蜜中果糖的含量范圍為42.27 g/100 g～47.79 g/100 g，葡萄糖的含量范圍為21.56 g/100 g～27.53 g/100 g，蔗糖為未檢出，麥芽糖為0.92 g/100 g～1.55 g/100 g，研究結(jié)果可以為蜂蜜的產(chǎn)品質(zhì)量控制和摻假檢測提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)對(duì)鵝掌柴蜂蜜摻假果葡糖漿、玉米糖漿和麥芽糖漿的糖類組分和含量進(jìn)行分析，建立果糖與麥芽糖含量與摻假物質(zhì)含量的等值線直觀圖，當(dāng)摻假物質(zhì)為果葡糖漿時(shí)，葡萄糖、果糖和蔗糖的變化差異性不大，當(dāng)摻假物質(zhì)為玉米糖漿和麥芽糖漿時(shí)，果糖和葡萄糖的含量隨著摻假量的增加而減少，麥芽糖含量隨著摻假量的增加而增加，蔗糖含量均為未檢出；建立鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，對(duì)摻假蜂蜜進(jìn)行相似度分析混合摻假蜂蜜中，鵝掌柴蜂蜜的相似度均大于0.999，其它類別樣品的相似度均低于0.99；鵝掌柴蜂蜜中果糖的含量范圍為42.27 g/100 g～47.79 g/100 g，葡萄糖的含量范圍為21.56 g/100 g～27.53 g/100 g，蔗糖為未檢出，麥芽糖為0.92 g/100 g～1.55 g/100 g研究結(jié)果可以為蜂蜜的產(chǎn)品質(zhì)量控制和摻假檢測提供理論依據(jù)。

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