影響雙酶復配同步酶解制備核桃多肽的因素

王紀輝，田婭玲，侯娜，*，耿陽陽，胡伯凱，梁美，何佳麗

（1.貴州省林業科學研究院貴州省核桃研究所，貴州貴陽550005；2.黔東南民族職業技術學院，貴州黔東南苗族侗族自治州556000）

核桃（Juglans regia），又稱胡桃、羌桃，為胡桃科植物。核桃富含脂肪、蛋白質等營養成分，即可生食，又可作為食品輔料進行添加[1]，目前核桃已經成為高效優質補品之一。核桃蛋白為優質蛋白質，每100 g核桃含有蛋白質16.67 g[2]，核桃蛋白中氨基酸種類齊全，含有8種必需氨基酸[1]，氨基酸中以精氨酸、谷氨酸含量最高[3-4]，在開發植物蛋白方面具有很大的市場前景。有關研究表明：冷榨后的核桃餅粕中蛋白質含量高達33.2%[5]，而目前我國的核桃餅粕大都用于飼養牲畜[6]，對核桃餅粕中富含的蛋白質資源造成極其不合理的利用與浪費[7]。有關科學研究發現，核桃多肽的生理活性較高，具有抑制炎癥，清除體內自由基，延緩衰老等功能[8-9]，大力開發集天然、安全、高效于一身的核桃多肽抗氧化劑具有很廣闊的市場潛力[10-11]。然而，目前對于水解核桃餅粕制備核桃多肽的研究大都集中于單一酶類，針對復合酶水解制備核桃多肽的研究則較少[12-14]，如果以不同酶類進行復合，充分利用其協同增效作用，對于提高核桃餅粕的水解程度具有重要的意義[15]。

因此，本研究以冷榨后的核桃餅粕為原料，水解度為考察指標，以雙酶復配同步水解核桃餅粕為基礎[16]，通過單因素和正交試驗對雙酶復配酶解核桃餅粕制備核桃多肽進行優化，研究結果對充分利用核桃副產物，提高核桃附加產值，助力貴州省實現脫貧攻堅具有重要的現實意義[17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃冷榨餅粕：（實驗室自制）；正己烷（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；木瓜蛋白酶（72×104U/g）、中性蛋白酶（14×104U/g）、堿性蛋白酶（9.3×104U/g）、胰蛋白酶（11×104U/g）、鄰二氮菲、氫氧化鈉（分析純）：四川化工有限公司；DPPH（分析純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

50T型液壓榨油機：河南貝斯德糧油機械工程公司；101-1型電熱鼓風干燥箱：鶴壁市天冠儀器儀表有限公司；L5S型紫外可見分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；FD1A-50型冷凍干燥機：江陰市新申寶科技有限公司；FW-100型高速萬能粉碎機：北京成萌偉業科技有限公司；TDL-40B型離心機：常州市儀都儀器有限公司；DEITA320型酸度計：上海平軒科學儀器有限公司；85-2A型恒溫磁力攪拌器：常州金壇良友儀器有限公司；HH-54型恒溫水浴鍋：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 核桃多肽制備

1.3.2 蛋白質水解度的測定

總氮的測定采用凱氏定氮法GB 5009.5-2016《食品安全國家標食品中蛋白質的測定》，氨態氮的測定采用雙指示劑甲醛滴定法[18]。核桃餅粕中蛋白質水解度計算公式如下：

1.3.3 單因素試驗

選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶作為水解酶類，在復合酶質量配比為（1∶1、1∶2、1∶3、2 ∶1、3 ∶1）、底物質量濃度為（10、20、30、40、50g/L），酶添加量為（1%、3%、5%、7%、9%），溫度為（30、35、40、45、50、55、60 ℃），pH 值為（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），酶解時間為（2、3、4、5、6 h），測定核桃餅粕中蛋白質的水解度，考察酶種類、復合酶配比、底物質量濃度、酶添加量、溫度、pH值、時間對核桃餅粕中蛋白質水解效果的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素研究的基礎上，依據單因素研究結果，選擇溫度、pH值、底物質量濃度、時間、酶添加量為研究因素，以水解度為指標，研究影響雙酶復合水解核桃餅粕制備核桃肽的因素。正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 統計分析

研究數據（3次數據平均值±標準偏差）采用Excel2007制圖及SPSS19.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶種類的選擇

按復合酶質量配比為1∶2（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶2）、溫度35℃、pH 值 6.0、底物質量濃度 30 g/L、時間3 h、酶添加量3%，研究酶種類對水解度的影響，結果見圖1。

由圖1可以看出，4種蛋白酶均可以酶解核桃餅粕制備核桃多肽，然而4種酶的水解能力卻有所不同，4種酶的水解能力大小順序為中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰蛋白酶，其中中性蛋白酶與木瓜蛋白酶之間差異性顯著（p＜0.05），并且這2種酶與堿性和胰蛋白酶之間均呈現顯著性差異（p＜0.05），但堿性蛋白酶與胰蛋白酶之間無顯著性差異。4種蛋白酶均在其最適條件水解相同時間后，中性蛋白酶水解度最高（8.47%），效果最佳，胰蛋白酶水解程度最差（5.94%）。因此，后續研究選擇中性蛋白酶和木瓜蛋白酶作為水解酶類。

圖1 酶種類對水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme species on degree of hydrolysis

2.1.2 復合酶質量配比對水解度的影響

以中性蛋白酶和木瓜蛋白酶為水解酶，按溫度35℃、pH值6.0、底物質量濃度30 g/L、時間3 h、酶添加量3%，研究復合酶質量配比對水解度的影響，結果見圖2。

圖2 復合酶質量配比對水解度的影響Fig.2 Effect of compound enzyme mass ratio on degree of hydrolysis

由圖2可知，復合酶質量配比為2∶1時（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶），核桃蛋白水解程度最大，并且與其它復合酶質量比均呈現顯著性差異（p＜0.05），復合酶質量配比為3∶1的水解度次之，但與復合酶質量配比為 1∶1、1∶2、1∶3也存在差異性（p＜0.05），而復合酶質量配比1∶2、1∶3之間差異性不顯著，但與復合酶質量配比為1∶1卻呈現顯著性差異（p＜0.05）。由于復合酶之間的協同增效作用，復合酶的水解程度高于單一用酶，綜上，后續研究選擇復合酶質量配比為2∶1。

2.1.3 溫度對水解度的影響

以復合酶質量配比為2∶1，按pH值6.0、底物質量濃度30 g/L、時間3 h、酶添加量3%，研究溫度對水解度的影響，結果見圖3。

圖3 溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

由圖3可知，核桃蛋白水解度隨溫度的升高呈現先升高而后逐漸降低的趨勢，在溫度為40℃時，蛋白水解度達到最大，并且與其它溫度梯度之間均呈現顯著性差異（p＜0.05），酶解溫度為45℃時的水解度與其余溫度梯度之間也出現顯著性差異（p＜0.05），核桃蛋白水解度僅次于40℃，此后核桃蛋白水解度下降趨勢加快，究其主要原因是水解能力強的中性蛋白酶活力逐漸降低直至失活，依上述分析得出后續研究選擇溫度為40℃。

2.1.4 pH值對水解度的影響

以復合酶質量配比為2∶1、溫度為40℃，按底物質量濃度30 g/L、時間3 h、酶添加量3%，研究pH值對水解度的影響，結果見圖4。

pH值是酶活性的關鍵參數之一。酶作為特殊蛋白質，它的分子構像以及其所處的解離狀態、底物分子的解離狀態都會依據pH值的不同而發生變化[19]，進而影響酶和底物結合、催化。所以只有處于適宜的pH環境條件下，酶和要催化的底物才能處于最易于結合的狀態，才能有效的對底物進行徹底催化[20]。

從圖4可以看出，pH值對核桃蛋白水解程度有顯著影響，在pH值為7.0時，核桃蛋白的水解程度處于最佳點，并且不同pH值之間的水解度兩兩之間存在顯著性差異（p＜0.05），之后隨著pH值偏于堿性，核桃蛋白水解程度明顯下降，綜上選擇pH值為7.0作為后續研究所需。

2.1.5 酶添加量對水解度的影響

以復合酶質量配比為2∶1、溫度為40℃、pH值為7.0，按底物質量濃度30 g/L、時間3 h，研究酶添加量對水解度的影響，結果見圖5。

圖4 pH值對水解度的影響Fig.4 Effect of pH on the degree of hydrolysis

圖5 酶添加量對水解度的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on the degree of hydrolysis

由圖5可知，核桃蛋白的水解度隨酶添加量的增大而逐漸升高，之后呈現下降趨勢，雖然加酶量越多，生成的產物也就隨之增加，但是酶解反應為可逆反應，生成的產物積累到一定程度時，就會反過來抑制酶解反應的進行，導致水解程度下降[21]；當酶添加量為5%時，水解程度最佳，與其它濃度梯度之間差異性均顯著（p＜0.05），酶添加量7%、9%之間差異性不顯著，但均與1%、3%呈現顯著性差異（p＜0.05），后者兩兩之間也存在差異性（p＜0.05），綜上選擇酶的最適添加量為5%。

2.1.6 底物質量濃度對水解度的影響

以復合酶質量配比為2∶1、溫度為40℃、pH值為7.0、酶添加量為5%，按時間3 h，研究底物質量濃度對水解度的影響，結果見圖6。

圖6 底物質量濃度對水解度的影響Fig.6 Effect of substrate mass concentration on hydrolysis degree

由圖6可知，底物質量濃度能顯著影響核桃蛋白水解度，底物質量濃度較低時，酶與底物不能充分接觸，反應速率慢，導致水解程度較低；適當的底物質量濃度有利于促進酶解反應向產物生成的方向移動[22]；而隨著底物質量濃度繼續增大，產物的生成量有所降低，其原因主要是，在底物質量濃度較大時，要被催化的底物蛋白之間發生交聯聚合現象[23]，導致酶與蛋白之間接觸的幾率減小，溶解性降低，黏度增大，引起酶解反應速率減緩，水解度下降[24]。底物質量濃度30 g/L、40 g/L之間無顯著性差異，但水解度高于30 g/L，以上兩者與其余濃度之間呈現差異性顯著（p＜0.05），綜上，選擇底物的最適質量濃度為40 g/L。

2.1.7 時間對水解度的影響

以復合酶質量配比為2∶1、溫度為40℃、pH值為7.0、酶添加量為5%，底物質量濃度為40 g/L，研究時間對水解度的影響，結果見圖7。

圖7 時間對水解度的影響Fig.7 Effect of time on the hydrolysis degree

由圖7可知，核桃蛋白水解度隨著酶解時間的延長呈現先上升而后逐漸趨于平緩，在酶解剛開始時，酶的活力強，產物生成量少，有利于酶解傳質過程的進行[25]，所以核桃蛋白水解度上升較快，當酶解時間為4 h時，蛋白酶的活性有所下降，此時游離多肽的增多對產物的生成抑制逐漸變大[26]，核桃蛋白水解程度逐漸變得緩慢趨于平衡。從差異性看可知，酶解時間4、5、6 h兩兩之間不存在差異性，均與2、3 h之間呈現顯著性差異（p＜0.05）。綜上，選擇酶解時間為4 h。

2.2 正交優化試驗

在單因素試驗的基礎上，以溫度（A）、pH值（B）、酶添加量（C）、底物質量濃度（D）、時間（E）為試驗因素，蛋白水解度為考察指標，采用L16（45）正交設計研究不同因素對核桃蛋白水解度的影響，正交試驗結果與分析見表2。

表2 核桃多肽制備工藝條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for walnut polypeptides preparation conditions optimization

由表2可知，以核桃蛋白水解度為評價指標時，影響核桃多肽制備工藝的因素主次為A＞B＞D＞C＞E，即溫度＞pH值＞底物質量濃度＞酶添加量＞時間，其最優的試驗組合為A3B3C2D2E2，即溫度為40℃、pH值為7.2、酶添加量為5%、底物質量濃度為40 g/L、時間為4 h，其中溫度對結果影響顯著（p＜0.05）；在正交試驗優化最佳條件下進行3次平行驗證試驗，核桃蛋白水解度為26.72%。所以，確定復合酶水解核桃餅粕蛋白制備核桃多肽的最佳制備工藝為：復合酶最佳質量配比為2∶1、溫度為40℃、pH值為7.2、酶添加量為5%、底物質量濃度為40 g/L、時間為4 h。

3 結論

本文對中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進行復合對雙酶水解核桃餅粕制備核桃多肽的影響因素進行研究，通過單因素和正交試驗確定了核桃多肽最佳制備條件為：復合酶最佳質量配比為2∶1、溫度為40℃、pH值為7.2、酶添加量為5%、底物質量濃度為40 g/L、時間為4 h，在此條件下核桃餅粕中蛋白質的水解度為26.72%。研究結果對核桃提質增效、促進核桃資源充分利用，助推貴州省核桃產業向前發展及助力國家脫貧攻堅具有重要的現實意義。

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