大豆分離蛋白肽-硒螯合物的制備及結構、抗氧化活性研究

張馨元 徐梁棕 汪少蕓

(福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108)

大豆分離蛋白(SPI)由于其均衡的營養價值已被廣泛應用于食品加工工業中[1]。硒是一種人體必需的微量元素，具有抑制腫瘤細胞增長、預防癌癥、延緩衰老、提高機體免疫力、防止克山病以及大骨節病等多種生理功能[2]。由于人體無法自身合成硒元素，故對于缺硒人群，食物補硒非常重要，而亞硒酸鹽或硒酸鹽等無機硒因其毒性大、用量控制難無法直接添加至食品中，通常將其轉化為安全性高的有機硒。

目前已有堿性蛋白酶酶解的大豆多肽-硒螯合物的制備工藝及抗氧化性的研究[3]，但未對制備所得的肽-硒螯合物結構進行表征，也未對螯合物在油脂體系中的抗氧化活性進行探究。本研究擬在蛋白酶的選擇及優化方法上加以改進，選擇能夠抑制苦味肽生成的復合風味蛋白酶對SPI進行酶解，改善酶解肽風味，并對多肽螯合物的結構進行表征，且進一步對其在脂質體系的過氧化能力進行研究，挖掘其在脂質體系的應用潛力，旨在為有機硒補充劑的制備及應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大豆分離蛋白：純度91.6%，福建圣農食品有限公司；

復合風味蛋白酶：2.0×105U/g，諾維信(中國)生物技術有限公司；

3,3′-二氨基聯苯胺：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

亞硒酸鈉：分析純，成都西亞化工股份有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平：AG264型，瑞士Mettler公司；

數顯PH計：FZ20型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；

電熱水浴鍋：DK-S28型，上海精密試驗設備有限公司；

井式消化爐：KDN-16型，鄭州長城科工貿公司；

紫外可見分光光度計：752型，上海光譜儀器有限公司；

冷凍干燥機：FD-1C-50型，北京博醫康試驗儀器有限公司；

熒光光譜儀：970CRT型，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白肽-硒螯合物制備工藝流程

大豆分離蛋白粉→稱量→加蒸餾水→90 ℃水浴預熱→調節pH→加酶→一定溫度水浴酶解→滅酶(沸水，10 min)→離心(8 000 r/min，15 min)→取多肽上清液與亞硒酸鈉溶液混合→調節pH→水浴加熱→冷卻→離心(1 000 r/min，10 min)→取上清液→乙醇沉降(加9倍體積的無水乙醇)→離心(8 000 r/min，10min)→收集沉淀物→醇洗滌沉淀3次→去除沉淀物中酒精→復溶→凍干

1.3.2 指標測定

(1) 水解度的測定：采用甲醛滴定法[4]。

(2) 硒含量和螯合力的測定：采用3,3′-二氨基聯苯胺比色法[5]。

(3) 吸收光譜測定：配置50 μg/mL的大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白肽-硒螯合物溶液，取體積為3 mL的樣品溶液于石英比色皿中，將波長設置為190～500 nm，進行紫外光譜掃描。重復掃描3次。

(4) 熒光光譜測定：配置0.1 mg/mL的大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白肽-硒螯合物溶液，取3 mL置于比色皿中，進行熒光光譜掃描。儀器的掃描條件是激發波長290 nm，發射波長的掃描范圍設置為300～500 nm，發射光與激發光縫寬均設為5 nm，靈敏度為3，采用高速掃描。

(5) 羥基自由基清除活力的測定：采用水楊酸法[6]。

(6) 還原力的測定：參照文獻[7]。

(7) 金屬螯合活力的測定：參照文獻[8]。

(8) 脂質過氧化抑制活性的測定：參照Osawa等[9]方法，修改如下：取濃度為1 000 μg/mL不同待測液1 mL于具塞比色管中，加入2 mL 95%乙醇、26 μL亞油酸及2 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L、pH 7.0)，充分混勻后，密閉放在暗處并保持40 ℃恒溫。空白組用1 mL蒸餾水代替樣品。每24 h測定一次體系過氧化程度。

1.3.3 大豆分離蛋白酶解條件優化 選用復合風味蛋白酶，在預試驗(以螯合力為主要指標，水解度為次要指標)基礎上，選取對螯合力影響較顯著的溫度、底物濃度及酶/底物3個因素，采用Box-Behnken進行優化設計，試驗因素水平編碼見表1。

1.3.4 大豆分離蛋白肽-硒螯合物制備工藝優化 在預試驗(以螯合力為指標)基礎上，采用Box-Behnken進行優化設計，試驗因素水平編碼見表2。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平及其編碼

表2 Box-Behnken 試驗因素水平及其編碼

2 結果與分析

2.1 響應面試驗結果

2.1.1 大豆分離蛋白酶解條件優化 響應面中心組合試驗結果見表3。采用Design expert 8.0.6軟件對酶解響應面設計的試驗結果進行多元回歸擬合和顯著性檢驗，結果見表4。以螯合力為Y值，得出溫度、底物濃度和酶/底物的三元二次回歸方程：

Y=39.82-2.47A-3.21B+2.53C-0.072AB-0.86AC+0.48BC-17.20A2-14.81B2-9.96C2。

(1)

表3 中心組合試驗設計及結果表

表4 中心組合試驗設計方差分析表?

? *.差異顯著(P<0.05)；**.差異較顯著(P<0.01)；***.差異極顯著(P<0.001)。

優化得到酶解的最優工藝為：溫度49.62 ℃、底物濃度2.89%、酶/底物5.13 g/100 g，預測螯合力為40.25 mg/g。為方便試驗操作調整螯合條件為溫度50 ℃、底物濃度3%、酶/底物5 g/100 g，對試驗預測結果進行驗證得螯合力為(38.14±1.33) mg/g，且在此條件下制備所得多肽經測定水解度為(23.57±2.17)%。

2.1.2 大豆分離蛋白肽-硒螯合物制備條件優化 響應面中心組合試驗結果見表5。采用Design expert 8.0.6軟件對螯合物制備響應面設計的結果進行多元回歸擬合和顯著性檢驗，結果見表6。以螯合力為Y值，得出溫度、時間和pH的三元二次回歸方程：

Y=46.69-2.47A-0.39B+8.21C+1.48AB-0.58AC-2.78BC-8.44A2-21.81B2-7.34C2。

(2)

優化得到螯合的最優工藝為：pH 10.58、時間1.97 h、溫度78.29 ℃，預測螯合力為49.27 mg/g。為方便試驗操作調整螯合條件為pH 10、時間2 h、溫度78 ℃，對試驗預測結果進行驗證得螯合力為(46.14 ±1.33) mg/g。

2.2 結構表征

2.2.1 吸收光譜 從圖1可以看出，SPIP和SPIP-Se的吸收光譜有顯著差異。SPIP的最強吸收峰在192 nm處，而SPIP-Se的最強吸收峰紅移至194 nm，且其峰強明顯增大，可能由于亞硒酸鈉溶液的加入，使多肽結構中原本的生色團和助色團結構發生改變，造成電子躍遷，生成了新的大豆分離蛋白硒化多肽復合物。

表5 中心組合試驗設計及結果表

表6 中心組合試驗設計方差分析表?

? *.差異顯著(P<0.05)；**.差異較顯著(P<0.01)；***.差異極顯著(P<0.001)。

2.2.2 熒光光譜 蛋白質中的色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)均可發射熒光，且由于其側鏈生色基團的不同而有不同的熒光激發和發射光譜。故氨基酸含量豐富的SPIP也具有一定熒光性，但由于其他元素與肽的結合，可導致熒光特性的變化，故可由熒光光譜推斷其結構的變化。從圖2可以看出，SPIP和SPIP-Se的熒光強度和出峰位置都有明顯差異。SPIP-Se的熒光強度顯著變弱，說明亞硒酸根與SPIP結合，導致熒光猝滅作用。這種現象的產生可能與金屬離子與蛋白肽反應導致熒光強度降低[10]類似。

圖1 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復合物的吸收光譜圖

圖2 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復合物的熒光光譜圖

2.3 抗氧化活性

2.3.1 羥基自由基清除活力 如圖3所示，SPIP和SPIP-Se均有一定的羥基自由基清除活力，且隨多肽濃度的增加，兩者的活力均有增強。在低蛋白濃度時，SPIP呈現比SPIP-Se更高的羥基自由基清除活力；但隨著蛋白濃度的增加至400 μg/mL 時，SPIP-Se的羥基自由基清除活力開始顯著增高，當蛋白濃度高于600 μg/mL時，其羥基自由基清除活力始終高于SPIP，在濃度為1 000 μg/mL時，SPIP-Se的羥基自由基清除活力達61.42%。

圖3 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復合物的羥基自由基清除活性

2.3.2 還原力 如圖4所示，SPIP和SPIP-Se均有一定的還原力，且兩者還原力隨濃度的增加而增強。同一濃度時，SPIP-Se具有更強的還原力。

圖4 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復合物的還原力

2.3.3 金屬螯合活力 如圖5所示，SPIP和SPIP-Se均有一定的金屬螯合活力，且兩者金屬螯合活力隨濃度的增加而增強。與SPIP相比，SPIP-Se有非常強的金屬螯合活力，可能是由于肽鏈上接入了大量帶負電荷的亞硒酸基團，靜電相互作用使其有很強的金屬螯合活力。

圖5 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復合物的金屬螯合活力

2.3.4 脂質過氧化抑制活性 亞油酸生成的過氧化物隨自氧化程度增加而增多，抗氧化劑的抗氧化力越弱，吸光值越高。如圖6所示，SPIP和SPIP-Se均對亞油酸自氧化有一定抑制作用，且SPIP-Se有較強的脂質過氧化抑制活性，可完全抑制亞油酸的自氧化反應。

3 結論

以硒螯合力為指標，通過響應面試驗得出復合風味蛋白酶酶解SPI的最優工藝和SPIP-Se的最優制備工藝為：酶解溫度50 ℃、底物濃度3%、酶/底物5 g/100 g；螯合反應pH 10、時間2 h、溫度78 ℃，所得SPIP-Se螯合物的硒含量為46.143 mg/g。采用吸收光譜和熒光光譜進行結構表征，表明硒元素與SPIP有一定結合，并產生新的物質，使SPIP原本的結構發生變化。SPIP-Se有高于SPIP的羥基自由基清除活性、還原力、金屬螯合活力，且脂質過氧化抑制活性試驗表明濃度為1 000 μg/mL的SPIP-Se即可完全抑制亞油酸自氧化反應，證明SPIP-Se在脂質體系中有較強的抗氧化潛在應用價值。

圖6 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復合物的脂質過氧化抑制活性

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