不同誘變處理對苜蓿葉片細胞顯微和超微結構的影響

馮鵬,孫力,申曉慧,李如來,李增杰,李志民,鄭海燕,姜成,楊鶴,劉俊剛,郭偉,張英俊

(1.黑龍江省農業科學院博士后工作站，黑龍江 哈爾濱150086；2.黑龍江省農業科學院佳木斯分院，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江 佳木斯 154003；4.中國農業大學動物科技學院，北京 100193)

葉片是植物體進行光合作用的營養器官，同時也是對環境變化最為敏感的器官，其形態結構特征最能體現環境因子的影響或植物對環境的適應[1]。結構是功能的基礎，植物生理功能的改變是由植物葉片結構的變化所致[2]。研究植物葉片形態解剖結構是對外界環境的適應性的反應，葉片形態解剖結構對環境的響應機制是探索植物適應環境對策的基礎。

誘變育種(Mutation breeding)是利用物理、化學和生物等因素誘導植物遺傳性發生各種變異，并從變異群體中選擇符合育種目標的個體，進而育成新品種或新種質的育種方法[3]。高等植物在不同逆境脅迫下，細胞的結構也會發生不同程度的改變，這一改變與植物所受脅迫程度和本身的抗逆性關系密切，誘變突變體為育種提供選擇材料。張文娟等[4]研究指出，空間誘變后德福、德寶、阿爾岡金、三得利4個苜蓿品種葉片厚度增加，葉脈突起度降低，柵欄組織顯著增厚；與對照相比，德福的細胞結構緊密度、細胞結構疏松度與對照差異均不顯著，阿爾岡金的細胞結構疏松度與對照差異不顯著，其他品種細胞結構緊密度、疏松度與對照均有顯著差異。馮鵬等[5]研究衛星搭載對苜蓿超微結構變化的影響，結果表明，空間飛行后植株葉片細胞超微結構均出現了不同程度的變化，對葉綠體的影響較大，線粒體也出現較為明顯的空洞和溢裂現象；夏曾潤等[6]通過不同濃度的甲基磺酸乙酯溶液誘變處理紫花苜蓿種子，結果表明，EMS處理抑制了M1代種子的最終發芽率、發芽指數和胚根胚芽長度，進而影響植株葉色，原因可能是葉片葉綠體結構發生變化。張蘊薇等[7]發現空間誘變處理紅豆草(Onobrychisviciaefolia)突變體細胞壁不規則增厚、扭曲，細胞質稀薄，液泡大，葉綠體變小，形狀多不規則。葉綠體內淀粉粒細小、數量多，基粒數減少，每個基粒內部的基粒片層直徑變小。

盡管零磁空間、60CO-γ射線、紫外線以及甲基磺酸乙酯處理對紫花苜蓿誘變的研究已有報道，但有關細胞顯微和超微結構的報道仍較少。通過分析誘變處理后細胞顯、超微結構的變化，旨在探明不同誘變處理對苜蓿葉片細胞及亞細胞結構的影響，為篩選最優誘變處理方法提供科學依據，選育適合高寒地區種植的苜蓿品種。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗于2015年10月-2017年6月在黑龍江省農業科學院佳木斯分院和沈陽農業大學農學院實驗室進行。試驗地是黑龍江省農業科學院佳木斯分院牧草試驗地。所在區域年平均降水量510 mm；土壤類型為草甸黑土，pH 為6.10，土壤有機質為2.65%、速效鉀為112.76 mg·kg-1、速效磷為44.50 mg·kg-1、堿解氮為135.41 mg·kg-1、全磷為0.14%、全氮為0.19%，全鉀為1.60%。

1.2 試驗材料

選取公農1號、Wega7F、WL319HQ、敖漢4個苜蓿品種，其中WL319HQ苜蓿是由北京正道生態科技有限公司提供，Wega7F、公農1號、敖漢苜蓿種子由黑龍江省畜牧研究所提供。

1.3 試驗設計

1.3.1零磁空間 零磁空間采用雙層磁屏蔽結構和線圈補償方式相結合的大型26面體磁屏蔽裝置，直徑為2.3 m，磁強 ≤20 nT，為地球磁強度的4×10-4倍。將4個苜蓿品種風干種子各10 g，3次重復，在室溫下經零磁空間處理180 d。

1.3.260CO-γ射線 4個苜蓿品種種子進行60CO-γ射線輻照處理，劑量分別為150、300、450 Gy，以0劑量處理作為對照，每個處理300粒，處理周期為7 d，3次重復。

1.3.3紫外線 選取籽粒飽滿的苜蓿種子300粒，將其包于紗布中，用45 ℃的蒸餾水浸泡1 h，用濾紙吸干種子表面的水分，再用0.1%的氯化汞溶液消毒 10 min。無菌水清洗 3～5次，將其置于紫外燈下40 cm處照射30、90 min。3次重復。

1.3.4甲基磺酸乙酯(EMS) 挑選成熟的苜蓿種子900粒，用濃硫酸處理5 min，蒸餾水沖洗多次。在4 ℃磷酸緩沖液 (100 mmol·L-1, pH 7.0)浸泡12 h使種子完全吸水膨脹。用磷酸緩沖液將EMS分別配制成濃度為0.1%、0.4% (v/v)的溶液，置于室溫黑暗條件下處理種子15 h，期間對藥劑浸泡的種子進行輕輕翻轉搖動，然后用蒸餾水反復沖洗，去除殘留種子表面的EMS溶液。

1.4 測定指標與方法

1.4.1顯微制片及觀察 選取誘變當代健康植株中部功能葉片，葉片沿中脈切取大小為5 mm×5 mm，用 FAA 固定液固定，常規石蠟切片法制片，切片厚度 5 μm，番紅-固綠雙重染色。Nikon-DIAPHOT顯微鏡上觀察。

1.4.2電鏡制片及觀察 取誘變處理和未經處理的苜蓿中部功能葉片，注意避開葉脈，切成長 1 cm、寬約0.5 cm 左右的小塊，迅速放入濃度 2.5%、pH 6.8 的戊二醛固定液中，同時抽真空使材料沉入固定液，在4 ℃下固定2 h后用 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH=6.8)沖洗2次，每次間隔時間為2 h，隨后采用濃度為50%、70%、80%、95%、100%的乙醇進行依次脫水，脫水后轉移至100%的丙酮內，最后用 Epon812包埋劑浸透包埋。利用 ULTRACUTE 型超薄切片機將包埋塊切成50～70 nm的薄片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，HITACI-II～HT7700 型透射電鏡下觀察，30000倍鏡下照相。

1.5 數據處理

采用 Motic Image 2000 1.3軟件進行顯微測量，測量葉片厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度、葉脈厚度，各顯微結構觀測值均為30個數值的平均值，并計算：

細胞結構緊密度 CTR(cell tense ratio)=柵欄組織厚度/葉片厚度×100%
細胞結構疏松度SR(spongy ratio)=海綿組織厚度/葉片厚度×100%
葉脈突起度VPD(vein protuberant degree)=葉脈厚度/葉片厚度

2 結果與分析

2.1 顯微結構

2.1.1葉片和葉脈突起度 不同誘變處理對苜蓿當代植株葉片顯微結構產生不同程度的影響，變異方向及變異程度因方法和誘變劑量不同而異[8-9]。4種苜蓿品種的葉片厚度在誘變后變化不同，但主要以葉片厚度增加為主。公農1號除30 min紫外線和0.1% EMS處理下葉片厚度低于對照，其他處理均顯著高于對照 (P<0.05) (表1)；Wega7F除EMS 0.1%處理下葉片厚度低于對照，其他處理也均顯著高于對照(表2)；WL319HQ和敖漢苜蓿在所有處理下葉片厚度全部顯著高于對照(表3，4)。各苜蓿品種誘變處理后，葉脈突起程度均顯著小于對照(P<0.05)(表1～4)。

2.1.2柵欄組織和海綿組織 葉片的厚度主要取決于柵欄組織厚度和海綿組織厚度[10]。葉片厚度隨柵欄組織厚度增加而增加，即柵欄組織越厚，葉片厚度越厚。不同苜蓿品種受不同誘變處理后，柵欄組織的厚度隨著葉片厚度變化而變化[11]。與對照相比，公農1號60CO-γ輻射、紫外線和EMS高劑量下均高于對照處理，同一誘變處理隨著劑量的增大，柵欄組織厚度增加，其他處理下均低于對照(表1)；海綿組織在紫外線30 min和0.1% (v/v)EMS處理及零磁空間處理下顯著低于對照(P<0.05)，其他處理均高于對照(表1)；Wega7F的柵欄組織均顯著高于對照，海綿組織多數處理條件下也顯著高于對照，但EMS處理下海綿組織厚度均低于對照(表2)；WL319HQ苜蓿的柵欄組織均顯著高于對照(P<0.05)(表3)。

注：表中同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。EMS: 甲基磺酸乙酯。下同。

Note: Different small letters in the same column indicate significant differences at theP<0.05 level. EMS: Ethylmethane sulfonate. The same below.

表2 誘變處理對Wega7F葉片主要結構特征影響Table 2 Comparison of main structural features of Wega7F under different mutagenic treatments (μm)

2.1.3細胞結構緊密度(CTR)和細胞結構疏松度(SR) 供試的4 個苜蓿品種葉片結構細胞結構緊密度、細胞結構疏松度變化各不相同。與對照相比，公農1號苜蓿只在紫外線處理下CTR顯著低于對照(P<0.05)，其他處理與對照差異不顯著(表1)；公農1號60CO-γ輻射和紫外線處理SR均高于對照，其他處理低于對照(表1)；誘變后Wega7F CTR升高；SR只是60CO-γ的150 Gy輻射處理、紫外線處理和0.4% EMS處理高于對照；敖漢苜蓿與對照相比，除150 Gy處理的CTR顯著高于對照外，其他所有處理下CTR均低于對照處理，只有EMS 0.1%處理CTR高于對照，說明敖漢苜蓿誘變后細胞結構較為松散(表1～4)。

表3 誘變處理對WL319HQ葉片主要結構特征影響Table 3 Comparison of main structural features of WL319HQ under different mutagenic treatments (μm)

表4 誘變處理對敖漢苜蓿葉片主要結構特征影響Table 4 Comparison of main structural features of Aohan under different mutagenic treatments (μm)

2.2 超微結構

從圖1可以看出，WL319HQ對照組葉肉細胞中的葉綠體靠近細胞壁整齊排列，形狀規則呈近紡錘形，葉綠體膜完整無缺，基粒片層結構排列整齊、均勻、緊密，淀粉粒較小，含量較少。在紫外線(30 min)和EMS[0.1% (v/v)]低劑量或濃度處理下，葉肉細胞中的葉綠體形狀仍較規則，片層結構和垛疊結構排列整齊，但部分垛疊結構開始模糊，線粒體脊部分消失，質體數量減少，少量片層溶解，但在150 Gy輻射處理下，葉肉細胞超微結構除具有前面的其他處理低劑量的特征外，此處理下的垛疊結構全部有腫脹現象。高劑量處理下[450 Gy60Co-γ，90 min紫外線，0.4% (v/v) EMS]，多數細胞壁仍然完好，但個別細胞壁完全溶解，內容物全部外滲至細胞間隙，葉綠體膜溶解，個別葉綠體膜有向外突起現象，質體明顯增多，片層結構逐漸溶解，個別垛疊結構增厚，部分有溶解模糊現象，在完整細胞內，胞漿向四周擴散，淀粉粒增多，多數線粒體脊消失。零磁空間處理下，細胞內一些變化同高劑量處理相似，但是細胞壁處理有完全溶解現象外，細胞壁上還有分泌物質存在，質體數量下降，細胞充滿內含物，淀粉粒多，且增大。

圖1 WL319HQ葉片細胞超微結構(×30000)Fig.1 Ultrastructure of WL319HQ (×30000) a: CK; b: 0.1% EMS處理; c: 30 min紫外線處理; d～e: 90 min紫外線處理; f: 150 Gy輻射處理; g: 300 Gy輻射處理; h～i: 450 Gy輻射處理; j～k: 0.4% EMS處理;l: 零磁空間處理。 CW: 細胞壁; VA: 液泡; CH: 葉綠體; M: 線粒體; S: 淀粉粒; D: 垛疊結構; P:質體。 a: CK; b: 0.1% EMS treatment; c: 30 min UV treatment; d-e: 90 min UV treatment; f:150 Gy radiation treatment; g: 300 Gy radiation treatment; h-i: 450 Gy radiation treatment; j-k: 0.4% EMS treatment; l: magnetic field free space. CW: cell wall; VA: vacuole; CH: chloroplast; M: mitochondrion; S: starch grain; D: crib fold structure; P: plasmid.

3 討論

植物處于逆境下，其形態學特征、生理生化特征以及細胞結構均產生變化，細胞結構的改變既是基因變異的反映[12]，又是對環境的適應性的體現[13-14]。所以通過對顯微結構變化的研究分析可以探究其微觀變異機理，同時也可以通過對顯微結構特征的了解來篩選出抗寒性強的誘變方法及有益突變體植株。通常情況下，葉片厚度，葉肉柵欄組織、海綿組織和葉脈等形態解剖結構變化多數是由于外部環境變化所致[15]。植物的柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片組織結構緊密度、疏松度等細胞結構特性均與植物抗逆性有一定關系。由于葉肉細胞結構緊密程度主要是針對柵欄組織而言，所以細胞結構緊密度用柵欄組織厚度占葉片厚度比例的相對值來體現，柵欄組織也被用來作為抗寒指標進行研究[16]。Pavel等[17]認為細胞結構緊密程度越大，該品種的抗寒能力越強。房用等[18]對茶樹的細胞結構分析認為，茶樹細胞柵欄組織厚度、柵欄組織層次、柵欄組織結構排列緊密程度以及柵欄組織厚度與海綿組織厚度的比值與茶樹的抗寒具有正相關關系。馮鵬[19]研究表明，空間搭載后，紫花苜蓿高水分含量葉片厚度增加，海綿組織厚度和緊密程度也有所增加。張蘊微等[20]研究表明，對于苜蓿葉片顯微結構來說，海綿組織和柵欄組織在空間誘變處理下反應效應不同，空間誘變對海綿組織的影響大于對柵欄組織的影響，空間搭載后，苜蓿葉片海綿組織結構與對照達到差異顯著水平，但柵欄組織與對照差異不顯著。本研究結果表明，誘變后葉片厚度、葉脈突起度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和細胞組織結構緊密度等指標均會產生變異，誘變方法和苜蓿品種不同，變化程度也不同，與對照相比，供試苜蓿品種葉片厚度多數呈增加趨勢，而葉片細胞結構緊密度增加，有利于增強其抵御逆境的能力和抗寒性的提高。公農1號苜蓿的柵欄組織厚度在450 Gy輻射誘變和90 min紫外線處理下增加，Wega7F、WL319HQ和敖漢苜蓿的柵欄組織與對照相比均呈增加趨勢，各品種的海綿組織厚度則隨誘變處理的不同而增減不同，細胞結構的緊密度與疏松度和海綿組織變化相似，說明其變異方向及變異程度具有不確定性。本研究選取的4個苜蓿品種半同胞種子作為誘變材料，極大地減少了種子間遺傳背景的差異，并選擇葉片作為顯微結構的研究對象，可以更準確地反映植株對誘變條件的適應。

葉片對不同誘變反應都非常敏感[21]。葉片細胞顯微結構和超微結構經過誘變后都會發生顯著變化，如細胞壁薄厚不均勻[22]，葉肉細胞內部分細胞器退化消失[23]，細胞液泡變大[24]，細胞器被擠到細胞壁邊緣[25]，葉綠體變形或膜解體[26]。楊鳳仙等[27]還觀察到低溫脅迫下葉綠體膜解體形似幾個變態葉綠體相互粘連堆疊在一起，大部分葉綠體的基質片層排列紊亂，有些片層融合而變得模糊不清或完全消失。王冬梅等[28]研究表明，番茄(Lycopersiconesculentum)葉片葉綠體在高溫脅迫下會膨大變圓，葉綠體被膜出現不同程度的斷裂、解體，類囊體片層松散，排列紊亂。這是由于細胞受到傷害后做出的應激反應所致。本研究中，與對照相比，尤其是在不同誘變高劑量和零磁空間處理下，葉綠體膜會有部分模糊或解體，基粒片層膨脹、溶解、基粒垛疊程度下降，個別也有增加，有的細胞壁完全破裂，內含物全部外泄，線粒體脊模糊，質體明顯增多并出現聚集現象。由于質體是一類與碳水化合物合成與儲藏有關的細胞器，質體增加能夠提高細胞活力，對于提高苜蓿抗寒性具有優勢作用[29-30]。本研究還發現，誘變處理后，葉綠素中的個別淀粉粒變多變大，說明光合產物淀粉在葉肉細胞葉綠體內的積累，能夠大大提高紫花苜蓿對寒冷的忍受能力，因為增加的淀粉解體時能夠釋放能量，這將更好的維持細胞較高的活性水平；同時解體的淀粉粒還具有提高細胞質濃度、增加滲透壓及吸水力以及提高其抗逆性的作用。

4 結論

1)誘變處理增加了苜蓿葉片厚度，但降低了葉脈突起程度；細胞淀粉粒變大，數量變多，有助于提高苜蓿的抗寒性能。

2)在一定梯度范圍內，60CO-γ射線和EMS誘變效率較高，突變體材料豐富，操作簡單，適宜于誘變育種的實際操作。

3)150 Gy60Co-γ射線、60 min紫外線、0.4%濃度EMS處理為苜蓿正向變異處理，有利于篩選有益誘變突變體。

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