人參蛋白的提取和體外免疫調節活性研究

王鈺瑩，閆福源，閆凱麗，王任晶，許 寧，王丹陽，汪 瑩，何慧楠，劉 莉

（長春中醫藥大學藥學院，長春 130117）

人參為五加科植物人參（Panax ginseng C. A.Meyer.）的干燥根及根莖。人參被人們視為百草之王，具有大補元氣、補脾益肺、生津止渴等功效[1]。人參具有多種化學成分，主要包括皂苷類、揮發油類、氨基酸類、脂肪酸類、糖類、蛋白質及多肽、無機鹽類等[2-6]?，F代藥理學研究[7-9]表明，人參具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、降血糖等活性，并對其他藥理活性起著協同調節作用。人參皂苷被認為是人參的主要活性成分，近年來的研究[10-13]表明，人參多糖，人參蛋白等大分子也具有明顯的生物活性。本研究針對人參當中的大分子物質蛋白質進行提取和性質檢測，并以小鼠巨噬細胞為研究對象，對人參蛋白體外的免疫調劑活性進行初步的探索研究，為把人參蛋白開發成保健食品的原料提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 DMEM培養基，購于Gibco公司；MTT（噻唑藍），購于Thiazoly公司；DMSO，國藥集團化學試劑北京有限公司；PGE2酶聯免疫測定試劑盒、TNF-α酶聯免疫測定試劑盒，購自上海朗頓生物科技有限公司；脂多糖（LPS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS） 均購于 Sigma 公司；Infinite 200 Pro型酶聯免疫檢測儀，購自瑞士TECAN公司，3111型CO2培養箱購自Thermo Forma公司。

1.2 細胞株 小鼠巨噬細胞樣細胞株 RAW 264.7（ATCCTIB-71），購自武漢普諾賽生物技術公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 人參蛋白的提取 稱洗凈鮮人參500 g，加入濃度為0.01 mol/L，pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液5 000 mL，勻漿，4 ℃ 浸提，每隔1 h用0.01 mol/L的Tris溶液調節pH至中性，浸提12 h后，用絹布過濾浸提液，濾渣加入5 000 mL Tris-HCl緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）4 ℃浸提12 h，用兩層絹布過濾浸提液，合并浸提液，4 000 r/min離心20 min，收集上清。用中空纖維膜過濾系統超濾（0.45 μm）和微濾（MW 10 000）浸提液，收集大分子濾液，向濾液中緩慢加入(NH4)2SO4，使飽和度達到75%，4 ℃沉淀12 h后，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，用少量蒸餾水溶解，透析（MW 8 000），凍干，即得人參總蛋白（GP）。

1.3.2 人參蛋白的含量測定 采用lowry法測定蛋白含量，按照試劑盒使用說明書測定人參蛋白的含量。

1.3.3 人參蛋白分子量分布測定 采用SDS-PAGE電泳測定人參蛋白的亞基分子量分布。

1.3.4 細胞毒性實驗 在RAW 264.7細胞培養3代生長狀態穩定后，將RAW 264.7細胞制成細胞懸液，用血球計數板計算細胞懸液中細胞個數，使其細胞密度為2×105個/mL，鋪于96孔板，每孔100 μL。適宜條件下培養。待細胞貼壁后加入不同濃度藥物每孔20 μL，分別是 50、100、200 μg/mL，補加培養基至100 μL，平行設6組，空白組以同體積無菌PBS代替，陽性對照組加入同體積20 μg/mL LPS，培養24 h。用MTT法檢測細胞存活率：加入濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養4 h，將培養基吸出，加入180 μL DMSO，振搖10 min，在波長490 nm處，測定OD值。

1.3.5 NO含量檢測 將細胞密度為1×106個/mL的細胞液接種于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃，5%CO2的培養箱中培養6 h。參照NO含量測定試劑盒說明，振搖10 min，在波長490 nm處，測定OD值，根據標準孔繪制出亞硝酸濃度與光度值的標準曲線，并計算樣品孔NO濃度。

1.3.6 PGE2、TNF-α含量檢測 細胞培養液中PGE2的測定參照酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒說明，細胞懸液在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，吸取上清20 μL進行酶聯免疫吸附反應，在450 nm測定吸光度值（OD值），計算PGE2含量。 細胞培養液中TNF-α的測定參照酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒說明，細胞懸液在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，吸取上清20 μL進行酶聯免疫吸附反應，在450 nm測定吸光度值（OD值），計算TNF-α含量。

1.4 統計學方法 數據均以均數±標準差（）表示。t 檢驗采用SPSS 19.0軟件完成，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參蛋白的蛋白含量和分子量分布 采用lowry法測定人參蛋白的蛋白含量為1.95 mg/mL，人參蛋白的亞基分子量從8 kD 到 66 kD，其中分子量為28 kDa的和26 kDa的蛋白含量最高。

2.2 人參蛋白對RAW264.7細胞活性的影響 見圖1。細胞吞噬能力與樣品濃度呈量效關系。結果表明，人參蛋白具有增強細胞吞噬能力的作用（P＜0.01）。

圖1 人參蛋白對RAW 264.7細胞活性的影響

2.3 人參蛋白對RAW 264.7細胞釋放NO的影響 測定NO含量所得標準曲線為Y = 0.013 2 X+0.106 9，R2=0.999 3。結果空白組產生NO最少，陽性對照組分泌的NO含量最高，給藥濃度增加，細胞分泌的NO含量也增加。實驗組與空白組相比均有統計學意義（P＜0.01），且各實驗組NO濃度均低于陽性對照組。

2.4 人參蛋白對RAW 264.7細胞分泌PGE2、TNF-α的影響 見圖2。

如圖2所示，與空白組相比，給藥組細胞分泌的PGE2較多。人參蛋白可以促進巨噬細胞分泌PGE2，使其上清中PGE2含量增加，和空白組對比差異具有統計學意義（P＜0.01）。

圖2 人參蛋白對RAW 264.7細胞分泌PGE2、TNF-α的影響

實驗所配置的藥物濃度均能使細胞分泌TNF-α的含量增加，與空白組比較，P＜0.01，藥物濃度最大時，細胞分泌TNF-α含量最高。各組TNF-α分泌量相比，陽性對照組含量最高，說明人參蛋白促進細胞分泌TNF-α的同時，對細胞作用溫和。

3 討論

近年來，有文獻[14]表明，人參可以提高淋巴細胞的增殖能力，說明人參具有免疫增強的作用。本實驗研究從人參中提取的人參蛋白對巨噬細胞的免疫調節作用，實驗結果表明，巨噬細胞經過人參蛋白作用后，釋放NO含量，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和前列腺素E2（PGE2）的含量增加，并且對細胞無毒性。當人參蛋白濃度較大的時候，作用較為顯著且溫和。人參蛋白可以提高巨噬細胞的免疫功能，其中的作用機制可以進一步研究。本研究表明不同濃度的人參蛋白作用于RAW 264.7細胞，細胞NO分泌增多，說明人參蛋白可通過上調限制酶iNOS的表達來促進NO分泌，增強巨噬細胞殺死病原微生物的能力[15-16]。

巨噬細胞還有免疫遞呈的作用。巨噬細胞免疫遞呈作用是通過釋放PGE2、TNF-α等免疫因子來實現的，這些免疫因子刺激T/B細胞，實現免疫級聯反應。本研究表明，不同濃度的人參蛋白可促進細胞釋放PGE2、TNF-α。

由上述結果可知，人參中的人參蛋白能夠增強巨噬細胞的免疫活性，可以從釋放免疫因子等方面增強免疫活性。人參可以作為增強免疫力保健品的原材料。

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