偽狂犬抗原純化濃縮工藝研究

劉國英 郝鵬 陳光達 李志鵬/金宇保靈生物藥品有限公司

偽狂犬病毒（Pesudorabies virus，PRV）屬于皰疹Ⅰ型病毒，PRV病毒粒子的核衣殼成正二十面體，帶囊膜的成熟病毒粒子直徑約120～300nm。自2011年以來，我國多地豬場暴發偽狂犬病，給我國養豬業帶來了較大影響。目前，急需生產出高質量偽狂犬疫苗來應對疫情的威脅。傳統的偽狂犬疫苗單位體積內抗原含量不高，免疫效果不佳；雜蛋白含量較多，免疫副反應較嚴重。本實驗通過中空纖維純化濃縮系統有效提高了每頭份疫苗的抗原含量，降低了雜蛋白和內毒素含量，提升了疫苗品質。

一、材料和方法

1.PRV種毒、主要試劑和儀器。PRV種毒（Bartha K61株）由本公司保存并提供，500 KD中空纖維柱購自GE公司。

2.實驗方案。（1）偽狂犬病毒原液離心。將懸浮培養收獲的偽狂犬病毒原液離心，棄去細胞碎片等沉淀，取上清液備用。（2）偽狂犬毒液濃縮及洗濾。將離心后病毒上清液400L通過500 KDa中空纖維系統進行切向流過濾濃縮，濃縮倍數到5倍時，使用PBS溶液洗濾。洗濾結束后，最終體積達到40L，達到10倍濃縮效果。

3.病毒滴度的測定。取原液樣、離心后樣、濃縮后樣品分別接種于鋪滿單層BHK細胞的96孔細胞板，每個稀釋度接種8個孔，每孔100μl，置于在5% CO2，37℃條件下培養3～5日，根據Reed-Muench法計算每個樣品的TCID50。

二、結果

1.雜蛋白去除率檢測結果。雜蛋白去除率檢測結果如表1所示，三批疫苗樣品純化濃縮后單位體積內雜蛋白含量雖然有所增加，但是總雜蛋白去除率分別達到了89.85%、89.82%、89.93%。

表1 蛋白含量檢測結果

2.病毒滴度測定結果。三批疫苗樣品純化濃縮前后病毒滴度測定結果如表2所示。

批次 濃縮倍數原液樣品TCID50/ml離心后樣品TCID50/ml濃縮后樣品TCID50/ml 1 10倍 8.00 7.75 8.75 2 10倍 8.25 8.25 9.13 3 10倍 7.75 7.50 8.63

三、討論

本實驗使用中空纖維純化濃縮系統對三批偽狂犬病毒液進行10倍濃縮，純化濃縮后的疫苗單位體積內抗原含量顯著增加，雜蛋白含量顯著降低。通過純化濃縮有效的解決由于抗原含量低導致的抗體效價低和雜蛋白含量高導致副反應嚴重的問題。

三批偽狂犬病毒液雖然離心后有部分損失，但10倍純化濃縮后，病毒滴度基本相應的增加了10倍。濃縮后單位體積內蛋白含量略有增加，但是總雜蛋白除去90%左右，配苗稀釋后每頭份疫苗中雜蛋白含量極低。

除了傳統的純化濃縮方法外，近些年出現的層析法純化濃縮系統、GEM純化濃縮技術等，成本高昂，技術不夠成熟不適合工業化生產等缺點。目前中空纖維純化濃縮系統在工業化生產中運用廣泛，技術成熟。

參考文獻（略）