新城疫滅活標記疫苗（MG7株）對新興土雞2號免疫持續期研究

王宏飛 羅瓊, 李延鵬 同戈 張曉楠 朱啟運 李慧敏 陳瑞愛,

1.肇慶大華農生物藥品有限公司

2. 華南農業大學

3.中國農業科學院蘭州獸醫研究所

新城疫是危害我國養禽業最嚴重的疫病之一，該病為OIE所規定的動物必報疫病，也是我國規定的一類動物疫病，世界各國對該病的防控和研究一直十分重視。目前我國防控新城疫主要使用La Sota和Clone30兩種疫苗株，二者均屬于基因Ⅱ型；而田間流行的毒株主要是基因Ⅶ型NDV，所以上述兩種疫苗不能在臨床應用上提供高效的免疫保護，雖然不出現嚴重臨床癥狀和死亡，但其組織器官在強毒感染下仍然會產生較嚴重的病變。而使用相同基因型的疫苗，不僅能有效降低攻毒后試驗動物的排毒率，而且能顯著減少喉氣管和泄殖腔中的病毒含量。使用與流行基因型一致的疫苗株來防控新城疫，對于有效控制疫病的發展具有絕對優勢。利用反向遺傳操作技術，將NDV的主要毒力基因F進行突變，將G7株的F蛋白裂解位點（RRQKRF）突變為La Sota弱毒株的裂解位點（GRQGRL），并在此基礎上，將NP蛋白的優勢抗原表位第443-460位氨基酸進行缺失，獲得雙突變株MG7，雞新城疫滅活標記疫苗（MG7株）是與當前我國流行株匹配的新型新城疫滅活疫苗。

本實驗室前期研究表明，利用雞新城疫滅活標記疫苗（MG7株）免疫SPF雞，20μl即可達到理想的保護效果，攻毒試驗結果顯示，不同日齡（10日齡和30日齡）SPF雞群均能抵抗流行的基因Ⅶ型強毒G7的攻擊，顯示出了該疫苗在控制我國新城疫的流行中具有廣闊的應用前景，本研究利用新興土雞2號研究了雞新城疫滅活標記疫苗（MG7株）在商品雞中的免疫持續期，以期為制定合理的疫苗免疫程序提供參考。

一、材料和方法

1.疫苗。肇慶大華農生物藥品有限公司中試生產的雞新城疫滅活標記疫苗（MG7株）。市售同類疫苗為雞新城疫滅活疫苗（La Sota株）和基因Ⅶ型重組新城疫病毒滅活疫苗（A-Ⅶ株）。

2.試驗雞。新興縣稔村溫氏家禽有限公司飼養的40日齡新興土雞2號。

3.驗用強毒。NDV強毒北京株（CVCC AV1611）（購自中國獸醫藥品監察所）和基因Ⅶ型G7株（蘭州獸醫研究所和肇慶大華農生物藥品有限公司保存）。

4.檢測用抗原。MG7抗原由肇慶大華農生物藥品有限公司保存。

二、試驗方法

1.雞新城疫滅活標記疫苗（MG7株）免疫后的血清學檢測。取40日齡新興土雞2號（1-40日齡時均按雞場正常免疫程序進行免疫）180只在隔離器飼養。在40日齡進行新城疫疫苗免疫，劑量均為單次免疫劑量0.5 ml，第1組隨機抽取40只免疫雞新城疫滅活標記疫苗（MG7株），第2組隨機抽取40只免疫市售La Sota疫苗，第3組隨機抽取40只免疫市售（A-Ⅶ株）疫苗，第4組為剩下60只作空白對照，在免疫前采血，免疫后的1、3、4、5、6、8個月分別對免疫雞群抽樣采血，每組采20份血樣，分離血清，用MG7抗原檢測HI抗體效價，確定試驗疫苗的免疫持續期。

2.雞新城疫滅活標記疫苗（MG7株）免疫后的攻毒試驗。40日齡新興土雞2號免疫后6個月，抽取方法2.1分組的免疫雞新城疫滅活標記疫苗（MG7株），La Sota株疫苗、（A-Ⅶ株）疫苗組各20只；另從對照組抽取20只作為攻毒對照組，另外20只作為空白對照組。采集血清后，免疫組和攻毒對照組（各20只）再分成2組，每組10只，第1組每只雞肌肉注射新城疫病毒北京株（CVCC AV1611）0.5 ml(含 105.0ELD50)，第 2組每只雞肌肉注射新城疫基因Ⅶ型G7株強毒0.5 ml(含105.0ELD50)，觀察14日，記錄雞群的精神、采食、死亡等情況，攻毒后5日采集泄殖腔拭子接種SPF雞胚進行病毒分離，對病毒分離陰性的，應在SPF雞胚再盲傳一次后進行判定。方法如下：泄殖腔拭子加入2 ml PBS（含青鏈霉素8000單位），死亡的雞采集適量的氣管、脾、法氏囊等臟器進行組織研磨，加入2 ml PBS（含青鏈霉素 8000 單位）。4℃，10000 rpm，離心 10min，取上清經尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.2 ml。雞胚接種后于36℃～37℃孵育120 h，期間每日照胚兩次，棄去24 h內死亡胚，24～120 h內死亡雞胚取雞胚液，置于2℃～8℃保存。至120 h將存活雞胚置于2℃～8℃放置4～24 h，收集雞胚液。檢測收集到的雞胚液的HA效價，每個樣品接種的5枚雞胚中只要有1枚雞胚液的HA價不低于1∶16，即可判為病毒分離陽性。對病毒分離陰性的樣品，再盲傳一次后再進行判定。盲傳后仍為陰性者，方判為病毒分離陰性。

成活率=實驗雞數量-新城疫死亡雞數量/實驗雞數。

三、試驗結果

在免疫前采血，免疫后的1、3、4、5、6個月分別對免疫雞群抽樣采血，每組采20份血樣，分離血清檢測HI抗體效價，使用MG7抗原作為檢測抗原，檢測結果見表2，免疫后6個月滅活標記疫苗（MG7株）疫苗組HI抗體為6.4 log2，而市售同類疫苗（A-Ⅶ株）疫苗組HI抗體為 5.2 log2，La Sota 株疫苗疫苗組 HI抗體僅為 4.1 log2。

表1 40日齡新興土雞2號免疫后效力結果（免疫 0.5 ml，N=20）

40日齡新興土雞2號免疫后6個月進行攻毒實驗，攻毒對照組雞有明顯精神不振、嗜睡，拉黃綠色稀糞等典型新城疫臨床癥狀，3～5 d內全部死亡。La Sota株疫苗組在肌肉注射新城疫基因Ⅶ型G7株強毒后，有兩只在第三天出現精神不振并在第5 d死亡，其余免疫攻毒組與空白對照組無明顯差異且全部健活。實驗結果表明免疫后6個月，免疫組雞能有效抵御新城疫強毒G7株和北京株的攻擊（見表2）。用北京株攻毒，3種疫苗免疫后成活率均為100%，病毒分離結果，La Sota株疫苗免疫組全部陰性，（MG7株）和（A-Ⅶ株）疫苗免疫組各分離1個陽性。用G7株攻毒，雞新城疫滅活標記疫苗（MG7株）和（A-Ⅶ株）疫苗免疫組成活率為100%，La Sota株疫苗免疫組成活率為80%，攻毒對照組全部死亡；攻毒后5日采集泄殖腔拭子進行病毒分離，MG7免疫組病毒分離全部陰性，La Sota株疫苗2個陽性，（A-Ⅶ株）疫苗免疫組1個陽性，保護效果略優于市售同類產品。

表2 新興土雞2號免疫攻毒保護實驗結果

四、討論

家禽養殖業用于防控新城疫的主要策略是疫苗接種，目前國內外使用的疫苗株La Sota為基因II型，距今已有70多年的歷史，有研究表明La Sota疫苗株與目前流行的新城疫病毒株在遺傳上有很大程度分歧。本研究利用新興土雞2號研究了雞新城疫滅活標記疫苗（MG7株）在商品雞中的免疫持續期，同時以市售同類疫苗雞新城疫滅活疫苗（La Sota株）和基因Ⅶ型重組新城疫病毒滅活疫苗（A-Ⅶ株）為對照，統一用MG7抗原進行HI抗體檢測，檢測結果發現La Sota株疫苗組抗體要低于MG7株疫苗組。本實驗室前期研究分別以MG7株和La Sota株抗原對在SPF雞免疫MG7和La Sota疫苗后獲得的陽性血清進行了交叉HI檢測。MG7株疫苗免疫血清抗體以MG7抗原進行檢測時，滴度為6.3 log2，以La Sota抗原進行檢測時，抗體滴度僅為為4.4 log2；La Sota株疫苗免疫血清以La Sota抗原進行檢測時，抗體滴度為5.9 log2，以MG7抗原進行檢測時，抗體滴度僅為4.7 log2（未發表資料）。結果表明，利用不同基因型新城疫抗原檢測，抗體相差1～2個滴度（log2）其抗原檢測同源血清時，抗體滴度較高。本研究結果顯示La Sota株疫苗抗體要低于MG7株疫苗的抗體，結果可能與異源抗原（MG7抗原）檢測有關，不同新城疫病毒基因型間抗原抗體交叉反應的差異型也進一步說明需要研發新的基因型相匹配的新城疫疫苗。

常規使用劑量（0.5 ml）免疫后測定新城疫滅活標記疫苗（MG7株）在商品雞中的免疫持續期，免疫后抗體在一個月達到高峰，達到9.1 log2，隨后抗體逐漸衰減，6個月時HI抗體檢測值為6.4 log2，用田間分離的NDV基因VII型強毒G7和傳統強毒北京株分別進行攻毒實驗，結果表明，單劑量免疫后持續期可達6個月，6個月時攻毒對G7株均能提供100%保護，北京株強毒攻毒后也是100%的成活率。而La Sota株疫苗在G7株攻毒后僅能提供80%的保護。盡管常規ND疫苗免疫后能夠降低發病率和死亡率，但不能有效阻止雞只繼續感染和向環境中排毒，傳播疫病。本研究在MG7株免疫6個月后用基因Ⅶ型G7強毒株和進行攻毒實驗，La Sota株免疫組在攻毒后有20%的雞分離到病毒；而MG7株免疫組在攻毒后未能檢測到病毒，表明在我國以基因Ⅶ型為流行株的環境下，相比傳統的La Sota疫苗，MG7株可更有效保護雞群并阻止排毒。

商品雞中的結果進一步表明，新城疫滅活標記疫苗（MG7株）具有良好的預防新城疫的作用。為了獲得比較理想的保護效果，建議商品雞在免疫新城疫滅活標記疫苗（MG7株）5個月時，加強免疫1次。

參考文獻（略）