以大黃素為聲敏劑介導聲動力療法對小鼠動脈粥樣硬化治療作用的研究

王立民 劉有旺 王恩波 閆兆龍 李雅林

摘 要：目的 探討以大黃素為聲敏劑介導聲動力療法對小鼠動脈粥樣硬化治療作用。方法 高脂飲食誘導ApoE-/-小鼠發生動脈粥樣硬化。將50只ApoE-/-小鼠分為不做任何處理的模型對照組、以5-氨基酮戊酸介導的陽性對照組、大黃素高、中、低劑量介導SDT組，每組 10只。除模型組外，其余各組自高脂4周起，分別進行相應的聲動力治療，隔天1次，于12周處死小鼠。取心臟，制備切片，通過油紅染色檢測斑塊大小。取主動脈，進行熒光定量PCR檢測基質金屬蛋白酶TMP-2、TMP-9和TIMP-1，分析對斑塊穩定性的影響。同樣檢測細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β，分析對炎癥的影響。結果 大黃素介導聲動力療法能減輕動脈粥樣硬化斑塊大小；顯著增加TIMP-1而降低TMP-2和TMP-9在主動脈的表達。顯著降低促炎性細胞因子TNF-α和IFN-γ而增加抗炎性細胞因子IL-10和TGF-β在主動脈局部的表達。結論 大黃素介導聲動力療法可能通過降低炎癥反應發揮抗動脈粥樣硬化作用，該方法對于動脈粥樣硬化的治療具有積極意義。

關鍵詞：大黃素；聲敏劑；聲動力療法；動脈粥樣硬化

中圖分類號：R364.1 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.06.019

文章編號：1006-1959（2018）06-0058-03

Study on the Effect of Emodin on the Treatment of Atherosclerosis in Mice

WANG Li-min，LIU You-wang，WANG En-bo，YAN Zhao-long，LI Ya-lin

（Taishan Medical College，Tai'an 271000，Shandong，China）

Abstract：Objective To investigate the therapeutic effect of emodin as a sonodynamic therapy on atherosclerosis in mice.Methods High fat diet induced atherosclerosis in ApoE-/- mice.50 ApoE-/- mice were divided into a model control group without any treatment，a 5- positive control group mediated by aminolevulinic acid，a large emodin，a medium and low dose SDT group，10 rats in each group.In addition to the model group，other groups were given fat 4 weeks，respectively，sonodynamic treatment，the next day 1， mice were sacrificed at 12 weeks.The heart was taken， the slices were prepared，and the size of the plaque was detected by oil and red staining.The aorta was taken and the matrix metalloproteinases TMP-2，TMP-9 and TIMP-1 were detected by fluorescence quantitative PCR，and the effect of the analysis on the stability of plaque was analyzed.The effects of cytokine TNF-α，IFN- gamma，IL-10 and TGF-β on the inflammation were also detected.Results Rhubarb mediated photodynamic therapy could reduce the size of atherosclerotic plaque，significantly increase TIMP-1 and reduce the expression of TMP-2 and TMP-9 in the aorta.The expression of anti-inflammatory cytokine TNF-α and IFN- gamma was significantly increased and the expression of anti-inflammatory cytokine IL-10 and TGF-β in the aorta was increased.Conclusion Emodin-mediated sonotherapy may play an anti-atherosclerotic role by reducing inflammatory response，which has a positive significance for the treatment of atherosclerosis.

Key words：Emodin；Sound sensitizer；Sonodynamic therapy；Atherosclerosis

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導致心腦血管疾病最重要的危險因素。盡管臨床上通過應用他汀類藥物降低血脂來防治動脈粥樣硬化有一定療效，但效果并不十分理想。聲動力療法（sonodynamic therapy，SDT）利用超聲對組織的較強穿透能力，以聲敏劑介導超聲對動脈粥樣硬化進行治療，具有較好的應用前景[1]。但開發合適的聲敏劑來介導SDT是一個急需解決的問題。國內一些研究證明從大黃中提取的大黃素在抗炎、穩定AS斑塊等方面具有良好的效果。本研究擬以大黃素為聲敏劑，介導SDT治療小鼠動脈粥樣硬化，觀察療效并探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 健康雌性ApoE-/-小鼠，50只，鼠齡 7周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。大黃素購自陜西西安森弗生物技術有限公司。油紅O，購自Sigma公司。反轉錄試劑盒及SYBR熒光定量PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。引物為自行設計，由上海生工生物工程有限公司合成。高脂飼料（21.32%脂肪，0.15%膽固醇）購自北京科澳協力飼料有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理 所有ApoE-/-小鼠適應性喂養1周后，隨機將小鼠分為不做任何處理的模型對照組、以5-氨基酮戊酸介導的陽性對照組、大黃素高、中、低劑量介導SDT組，每組 10只。模型組只進行高脂飲食12 周。從高脂第4周起，陽性對照組每隔1 d靜脈注射60 mg/kg 5-氨基酮戊酸2 h后，進行聲動力治療[2]。大黃素高、中、低劑量介導SDT組靜脈分別注射大黃素30、60和90 mg/kg 2 h后，進行聲動力治療。聲動力治療每次聲強為1.5 W/cm2，持續時間15 min，持續8周。

1.2.2心臟冷凍切片 用PBS進行心臟灌注，待肝臟顏色變白后，取小鼠的心臟，用OCT包埋后，用冷凍切片機進行冷凍切片，厚度為5 μm。留取主動脈根部大約30～40張切片用于后續實驗。用4%多聚甲醛固定15 min，儲存于-80 ℃備用。

1.2.3油紅染色及斑塊大小統計[3] 每只小鼠取10張主動脈根部切片，切片平衡至室溫后，用PBS沖洗2～3遍，60%異丙醇分色2 s；油紅O室溫染15 min；再用60%異丙醇分色3～5 s；蘇木素染色40 s， 甘油-水封片劑封片。圖像采集采用Nikon Labophot 2 顯微鏡及Spot RT3 彩色數碼相機。斑塊的定量分析采用雙盲法，用Image-Pro Plus software 6.0進行斑塊大小計算，每只小鼠取10張切片的平均值作為斑塊大小。

1.2.4熒光定量PCR檢測基質金屬蛋白酶及細胞因子 按上述方法進行心臟灌注，取主動脈進行RNA提取，取2 μg總RNA，采用反轉錄試劑盒進行反轉錄，然后采用SYBR試劑盒進行熒光定量PCR檢測[3]。基質金屬蛋白酶TMP-2、TMP-9和TIMP-1，細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β檢測。

1.3統計學分析 采用SPSS 17.0軟件系統進行分析，實驗數據用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為具有統計學意義，P<0.01表示差異有顯著的統計學意義。

2 結果

2.1大黃素介導聲動力療法能減輕動脈粥樣硬化斑塊大小 為了檢測大黃素介導聲動力療法對動脈粥樣硬化斑塊大小的影響，我們對主動脈根部的冷凍切片進行了油紅染色，并進行了斑塊面積的計算。與模型組比較，5-氨基酮戊酸介導的陽性對照組及SDT低、中、高劑量組斑塊面積和斑塊面積/官腔面積比值均顯著性降低，且具有劑量-效應依賴關系（P<0.05，P<0.01，表 1）。本結果表明，大黃素介導聲動力療法能減輕動脈粥樣硬化斑塊大小，具有較好的治療動脈粥樣硬化的作用。

2.2大黃素介導聲動力療法具有穩定動脈粥樣硬化斑塊的作用 為了檢測大黃素介導聲動力療法對斑塊穩定性的影響，我們采用熒光定量PCR方法檢測了主動脈局部與斑塊穩定性有關的基質蛋白酶家族（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制因子（，TIMP）的表達。MMPs可以通過促進血管壁細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的破壞來使AS斑塊變得不穩定[4]，TIMP是其內源性的抑制劑。與模型組比較，5-氨基酮戊酸介導的陽性對照組及SDT低、中、高劑量組主動脈局部TIMP-1的表達顯著升高，而TMP-2和TMP-9的表達均顯著性降低且具有劑量-效應依賴關系（P<0.05，P<0.01，表 2）。本結果表明，大黃素介導聲動力療法具有穩定動脈粥樣硬化斑塊的作用。

2.3大黃素介導聲動力療法可能通過降低炎癥反應發揮抗動脈粥樣硬化作用 為了探討大黃素介導聲動力療法抗動脈粥樣硬化的可能機制，我們檢測了促炎性和抗炎性細胞因子的表達。與模型組比較，5-氨基酮戊酸介導的陽性對照組及SDT低、中、高劑量組促炎性細胞因子TNF-α和IFN-γ在主動脈局部的表達顯著降低，而抗炎性細胞因子IL-10，TGF-β的表達顯著升高，且具有劑量-效應依賴關系（P<0.05，P<0.01，表3）。本結果表明，大黃素介導聲動力療法可能通過降低炎癥反應發揮抗動脈粥樣硬化作用。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種常見的慢性炎癥性心血管疾病，其中動脈粥樣硬化斑塊的破裂是急性心血管事件發生的主要原因，嚴重威脅人類健[3]。傳統的動脈粥樣硬化治療包括藥物治療和手術介入治療，是目前臨床患者的主要選擇。然而，這些療法仍存在一些副作用，例如抗血小板藥物治療會引起血小板含量過低，最終導致出血；抗血脂藥會導致肌病；手術介入治療則存在機械創傷大、術后再狹窄率高、支架內血栓發生率高的缺陷[3]。因此，尋求一種損傷小、靶向性強、副作用小的動脈粥樣硬化治療方法勢在必行。聲動力治療是一種無創、安全的治療方式，其在動脈粥樣硬化治療中具有潛在的應用前景[5]。

聲動力治療中使用的藥物為聲敏劑，是影響其療效的主要因素之一。大黃素是一種羥基蒽醌的衍生物，在抗炎、抗纖維化、清除自由基等方面具有良好的效果。大黃素可以干預大鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成[6]。另有研究報道，大黃素具有穩定小鼠斑塊的作用[4]。大黃素作為聲敏劑，是否可以通過聲動力療法發揮抗動脈粥樣硬化作用，卻鮮有報道。

本次研究結果表明，大黃素介導聲動力療法可以顯著降低動脈粥樣硬化斑塊大小，具有與已知陽性對照聲敏劑5-氨基酮戊酸介導聲動力療法相似的療效[2]。為了檢測該方法對斑塊穩定性的影響，我們檢測了與斑塊穩定性有關的MMP-2、MMP9和TIMP-1。MMP-2和 MMP-9是 AS斑塊中 MMPs的主要成分，與AS斑塊穩定性關系密切[4]。 MMP-2的主要底物包括明膠 Ⅳ（粥樣斑塊基底膜纖維帽的主要組成部分）、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原，彈性 蛋白及纖維連接蛋白等。MMP-9的底物包括明膠Ⅳ、Ⅴ型膠原和彈性蛋白[4]。TIMP-1是MMP的內源性抑制因子，降低斑塊局部MMPs而升高TIMP-1的表達，可以增強斑塊穩定性及預防斑塊的破裂，對降低心血管疾病的致殘率及致死率有非常重要的意義。本研究觀察到經過大黃素介導聲動力療法干預之后，小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的MMP-2、MMP-9表達降低，其內源性的抑制因子TIMP-1表達升高。表明該方法可以通過下調斑塊中MMP-2、MMP-9的表達，上調 TIMP-1的表達，在一定程度上改變斑塊的組織學構成，發揮穩定 動脈粥樣硬化斑塊的作用。

為了探討該方法的作用機制，我們檢測了促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子的在動脈局部的表達，結果發現SDT低、中、高劑量組促炎性細胞因子TNF-α和IFN-γ在主動脈局部的表達顯著降低，而抗炎性細胞因子IL-10，TGF-β的表達顯著升高。說明大黃素介導聲動力療法可能通過降低炎癥反應發揮抗動脈粥樣硬化作用。本研究為初步探討大黃素作為聲敏劑介導聲動力療法治療動脈粥樣硬化，雖然結果較理想，但仍有待于用更經典的方法如免疫組化進行進一步驗證某些實驗結果。

本研究結果為采用大黃素介導聲動力治療動脈粥樣硬化提供了重要的實驗依據和理論基礎。對于防治急性心血管臨床事件具有潛在應用價值。

參考文獻：

[1]寇佳媛，姜月晴，田野.中藥提取物聲敏劑在聲動力治療動脈粥樣硬化中的應用[J].上海大學學報，2016，22（3）：318-325.

[2]Li Z，Sun X，Guo S，et al.Rapid stabilisation of atherosclerotic plaque with 5-aminolevulinic acid-mediated sonodynamic therapy[J].Thrombosis and haemostasis，2015，114（4）：793-803.

[3]Li Y，Liu X，Duan W，et al.Batf3-dependent CD8α+ Dendritic Cells Aggravates Atherosclerosis via Th1 Cell Induction and Enhanced CCL5 Expression in Plaque Macrophages[J].EBioMedicine，2017（18）：188-198.

[4]白文武，劉運芳，鹿曉婷.大黃素穩定小鼠動脈粥樣硬化斑塊的機制[J].中國老年學雜志，2011，31（7）：1167-1169.

[5]Guo S，Sun X，Cheng J，et al.Apoptosis of THP-1 macrophages induced by protoporphyrin IX-mediated sonodynamic therapy[J].Int J Nanomedicine，2013（8）：2239-2246.

[6]張翔，江興林，周利玲，等.大黃素對大鼠動脈粥樣硬化形成的干預及對血清 T-AOC、 SOD 和 MDA 水平的影響[J].新中醫，2015，47（12）：230-231.

收稿日期：2017-9-12；修回日期：2017-9-25

編輯/成森