錘狀中鼓藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化

王永強，王 珺

（海南大學海洋學院/熱帶生物資源教育部重點試驗室/海南大學海洋生物試驗教學中心，海南 海口 570228）

錘狀中鼓藻〔Bellerochea malleus（Brightwell）Van Heurek〕屬硅藻門、中心綱、盒形藻目、盒形藻科、中鼓藻屬，可以作為水產(chǎn)動物的優(yōu)良餌料，還可以凈化養(yǎng)殖水環(huán)境。目前，國內(nèi)外有關(guān)中鼓藻的研究較少，楊聽林等［1］研究了中鼓藻的光控發(fā)育研究，林均民等［2］研究了中鼓藻三類大小細胞的生化組成，楊世民等［3］研究了中國海域浮游硅藻鐘形中鼓藻（Bellerochea horologicalisStosch）與錘狀中鼓藻的重要區(qū)別，部分調(diào)查文獻記載了鼓藻［4-6］。微藻的規(guī)模化培養(yǎng)是其開發(fā)利用的前提，而溫度、光照、鹽度等生態(tài)因子與微藻的生長繁殖密切相關(guān)。因此篩選出微藻適宜及最適的生態(tài)因子是提高藻細胞密度關(guān)鍵的第一步。此外，微藻的生長繁殖與氮、磷、鐵、硅等營養(yǎng)鹽密切相關(guān)，即藻類對營養(yǎng)鹽的需求有適宜及最適的種類及濃度。因此，越符合藻營養(yǎng)需求的配方，越能獲得較理想的培養(yǎng)效果。

我們前期在海南省熱帶海域分離獲得1株生長速度快、抗污染能力強的耐高溫錘狀中鼓藻。為了提高該藻的生長速率，獲得較高的生物質(zhì)產(chǎn)量，筆者研究了該藻主要生態(tài)因子（溫度、光照、鹽度）的適宜及最適范圍，并分別通過氮、磷、鐵、硅等礦質(zhì)營養(yǎng)元素以及維生素B1（VB1）、維生素B12（VB12）和維生素H （VH）等維生素正交實驗，優(yōu)化其培養(yǎng)基配方，以期為今后人工大規(guī)模培養(yǎng)錘狀中鼓藻提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

錘狀中鼓藻取自海南大學海洋學院藻種室，原種于2016年2月采自海南省陵水縣新村港自然海區(qū)，經(jīng)分離純化得到。藻體細胞環(huán)面觀呈扁帶狀，寬100 μm左右，為長且直的群體，相連細胞之間僅在鏈的兩側(cè)出現(xiàn)近菱形的小間隙［7］。在電鏡下，細胞角處殼面與殼套之間生有邊緣突［8］。試驗前接種到1 000 mL三角瓶中活化純培養(yǎng)，不充氣，每天早上、中午、晚上各搖動1次，取指數(shù)生長期的藻株進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 藻體培養(yǎng) 培養(yǎng)用的海水取自海口市美蘭區(qū)白沙門海域，經(jīng)濾袋及脫脂棉過濾，煮沸、自然冷卻后使用。海水鹽度為31.5，pH 值為8.03。試驗培養(yǎng)瓶選用150 mL三角瓶，經(jīng)洗液洗滌、晾干，120℃恒溫消毒2 h。各試驗組溫度控制在25（±1）℃（除溫度試驗外），光強3 000（±200） lx（除光照試驗外），光周期為14L∶10D，培養(yǎng)時間為4 d。每天早上、中午、晚上各搖動1次，并隨機交換培養(yǎng)瓶位置，以減少照度差異。本試驗的培養(yǎng)液均采用添加5.0 mg/L Na2SiO3的“寧波大學3#培養(yǎng)液”配方［9］。

1.2.2 試驗設(shè)計 生長曲線測定：在光照恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，接種密度為11.54×104cells/mL，溫度為25（±1）℃，光照為2 000 lx，每天定時計數(shù)，培養(yǎng)7 d。

生態(tài)單因子試驗：設(shè)溫度試驗梯度（15、20、25、30、35℃），培養(yǎng)瓶置于光照恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，接種密度15.38×104cells/mL；設(shè)光照試驗梯度（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 lx），培養(yǎng)瓶置于暗室培養(yǎng)架上，通過調(diào)節(jié)試驗瓶與光源的距離來調(diào)節(jié)光照強度，接種密度為11.54×104cells/mL；設(shè)鹽度試驗梯度（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55），分別用淡水、鹽度為30及60的培養(yǎng)液調(diào)配至所需要的鹽度，接種密度為15.4×104cells/mL。各試驗均設(shè)置2個水平試驗。

礦質(zhì)營養(yǎng)鹽的正交試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行礦質(zhì)營養(yǎng)鹽的正交試驗，參照正交試驗法［10］，選用 L18（35）設(shè)計（表1），接種藻細胞密度為9.23×104cells/mL，溫度為25（±1）℃，光照為2 000 lx，培養(yǎng)4 d后計數(shù)。

表1 營養(yǎng)鹽正交試驗因素水平

維生素正交試驗：維生素B1（VB1）、維生素B12（VB12）及生物素（VH）3因子4水平的正交試驗設(shè)計參照正交試驗法［10］，選用L16（43）設(shè)計（表2），接種藻細胞密度為 9.23×104cells/mL，溫度為25（±1）℃，光照為2 000 lx，進行試驗，培養(yǎng)4 d后計數(shù)。

1.2.3 藻細胞密度的測定 先用血球計數(shù)板（計數(shù)藻細胞密度）及可見分光光度計（測定藻液OD值）測出藻細胞密度與藻液OD值（A420，培養(yǎng)液為空白）的線性關(guān)系；測定試驗藻液的OD值，根據(jù)藻細胞密度與OD值的線性關(guān)系換算出試驗藻液的藻細胞密度。

表2 維生素正交試驗因素水平

1.2.4 生長速率的計算 藻細胞的生長速率K由以下公式計算：K=（lnXt- lnX0）/t

式中，Xt為經(jīng)過t時間培養(yǎng)后的藻細胞密度，X0為起始藻細胞密度，t為培養(yǎng)時間（d）。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 運用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖，并使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（方差分析、LSD多重比較）。

2 結(jié)果與分析

2.1 錘狀中鼓藻的生長曲線

從錘狀中鼓藻的生長曲線（圖1）可見，接種后第1 天藻細胞密度變化很小，屬于延緩期；接種后第2天就進入指數(shù)生長期，藻細胞密度直線上升，持續(xù)時間達3 d，然后進入相對生長下降期，藻細胞密度繼續(xù)生長，生長速率相對指數(shù)生長期有所減慢。

圖1 錘狀中鼓藻的生長曲線

2.2 錘狀中鼓藻培養(yǎng)的生態(tài)單因子試驗結(jié)果

圖2 溫度對錘狀中鼓藻生長的影響

2.2.1 溫度試驗 從圖2可知，錘狀中鼓藻在溫度為15～35℃范圍內(nèi)均可生長，溫度在15～30℃范圍內(nèi)，藻細胞的K值隨著溫度的增加而加大，30℃時達最大值，即30℃為最佳溫度。溫度在30～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，藻細胞的K值越來越小。方差分析結(jié)果表明，溫度對錘狀中鼓藻生長影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 光照試驗 從圖3可知，錘狀中鼓藻在1 000～8 000 lx光照條件下均可生長，在光強為1 000～4 000 lx范圍內(nèi)，隨著光強的增加，藻細胞的K值越來越大，4 000 lx時達最大。光強在4 000～5 000 lx范圍內(nèi)，隨著光強的增加，藻細胞的K值越來越小，光強在5 000～7 000 lx范圍內(nèi)，隨著光強的增加，藻細胞的K值幾乎無變化，當光強達8 000 lx時，藻細胞的K值減小。方差分析結(jié)果表明，光強對錘狀中鼓藻生長影響極顯著（P＜0.01）。

圖3 光照對錘狀中鼓藻生長的影響

圖4 鹽度對錘狀中鼓藻生長的影響

2.2.3 鹽度試驗 從圖4可知，錘狀中鼓藻在鹽度為5～50范圍內(nèi)均可生長，在鹽度為5～35時，藻細胞的K值隨著鹽度的增加而加大，鹽度為35時最大。在鹽度為35～50時，藻細胞的K值隨著鹽度的增加而減小，鹽度為55時K值為0。方差分析結(jié)果表明，鹽度對中鼓藻生長的影響極顯著（P＜0.01）。

2.3 錘狀中鼓藻培養(yǎng)的礦質(zhì)營養(yǎng)正交試驗結(jié)果

錘狀中鼓藻培養(yǎng)的礦質(zhì)營養(yǎng)元素正交試驗結(jié)果見表3，對K值進行直觀分析和多重比較，結(jié)果表明，試驗號5的組合對中鼓藻培養(yǎng)效果最好，即 NaNO3-N、NaH2PO4-P、FeSO4-Fe、Na2SiO3-Si和Na2MoO4質(zhì)量濃度分別為20.0、1.0、0.1、15.0、0.02 mg/L。

表3 錘狀中鼓藻培養(yǎng)的礦質(zhì)營養(yǎng)的正交試驗結(jié)果

2.6 錘狀中鼓藻培養(yǎng)的維生素正交試驗結(jié)果

錘狀中鼓藻培養(yǎng)的維生素正交試驗結(jié)果見表4，對K值進行的直觀分析和多重比較，結(jié)果表明，試驗號5的組合（VB1、VH濃度分別為1.0、0.05 mg/L）對錘狀中鼓藻培養(yǎng)效果最好，其次為9號組合（VB1、VH濃度分別為10.0、0.5 mg/L）。 VB12試驗效果不理想。

3 結(jié)論與討論

溫度、光照、鹽度、礦質(zhì)營養(yǎng)和有機營養(yǎng)是影響浮游植物光合作用的重要環(huán)境因子。這些環(huán)境因子的影響效應(yīng)主要表現(xiàn)在浮游植物是否可以生長繁殖以及生長繁殖的速度。在錘狀中鼓藻的培養(yǎng)過程中，不僅要注意控制生態(tài)因子，而且要合理選擇營養(yǎng)鹽種類及其濃度，才能獲得理想的培養(yǎng)效果。

表4 維生素的正交試驗結(jié)果

3.1 溫度

溫度是微藻生長繁殖極重要的生態(tài)因子之一，微藻的最適溫度范圍因種類不同而有所差異［9］。有研究者認為，溫度對海洋微藻的生長和發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，對酶的活性、營養(yǎng)物的吸收利用效率及細胞分裂周期等諸多方面都存在不同程度的影響［11］。大多數(shù)微藻的適溫范圍較寬，如小新月菱形藻（Nitzschia closteriumf.minu-tissima）生長的適宜溫度為 10～25℃，最適溫度為 20℃［12］。角毛藻（Chaetocerossp.）、小環(huán)藻（Cyclotellasp.）和直鏈藻（Melosirasp.）的最適溫度分別為 22.3、20.6、24.7℃［13］。本試驗結(jié)果表明，錘狀中鼓藻在15～35℃的溫度范圍內(nèi)均能正常進行生長繁殖，為其生長的適宜溫度，30℃時藻細胞的K值最大，為其最適溫度。可見，錘狀中鼓藻最適溫度相對其他藻類較高，適合海南夏季培養(yǎng)。

3.2 光照

對于光能自養(yǎng)的藻類，光強要超過光補償點，藻類的生物量才有可能增加［14］。不同的藻類，各有其適宜的光強。微小小環(huán)藻（Cyclotella caspia）適宜光強為500～10 000 lx，最適光強為 2 000～8 000 lx［15］；日本星桿藻（Asterionella japonica）生長繁殖適宜光強為500～8 000 lx，最適光強為1 000 lx［16］。本試驗結(jié)果表明，錘狀中鼓藻生長繁殖的適宜光強為1 000～8 000 lx，在光強為1 000～4 000 lx范圍內(nèi)，隨著光強的增加，藻細胞的K值越來越大，在光強達到4 000 lx時，K值最大。光強在4 000～8 000 lx范圍內(nèi)，隨著光強的增加，藻細胞的K值越來越小，這是微藻在過強的光照條件下出現(xiàn)了光抑制的原因［9］。

3.3 鹽度

不同微藻對環(huán)境鹽度變化的適應(yīng)能力不同，角毛藻、小環(huán)藻和直鏈藻的最適鹽度分別為12.6、6.1和6.7［13］。微小小環(huán)藻生長的適宜鹽度為 2～85，最適鹽度為 25～50［15］。本試驗結(jié)果表明，錘狀中鼓藻在鹽度為5～50的范圍內(nèi)，均能夠正常生長繁殖，最適鹽度為35。

3.4 礦質(zhì)元素

微藻需要從外界吸收無機礦質(zhì)元素來制造有機物［17］。氮是微藻生長最重要的大量元素之一，通常以硝酸鈉或尿素為氮源，不同種類的微藻所需的最佳氮質(zhì)量濃度各異。羅曉霞等［18］研究表明，斜生柵藻在氮濃度為 247 mg/L 時生長速率達到最高值，之后隨著氮濃度的繼續(xù)增加而下降。三角褐指藻誘變株生長需要最佳的氮濃度為20 mg/L［19］。本研究結(jié)果表明，錘狀中鼓藻最佳的氮質(zhì)量濃度為20 mg/L。磷也是微藻生長所需大量元素之一，藻體對磷的吸收受到環(huán)境影響，在二氧化碳缺乏的情況下，光照能促進磷的吸收，氮和磷有相互約束和促進的關(guān)系。鐵作為藻類生長發(fā)育所必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，鐵對不同藻類生長的生態(tài)學效應(yīng)各不相同。三角褐指藻誘變株生長需要最佳的鐵濃度為0.5 mg/L［19］。本研究結(jié)果表明，錘狀中鼓藻最佳的鐵濃度為0.1 mg/L。硅是硅藻必需的營養(yǎng)元素，除了作為細胞壁結(jié)構(gòu)成分外，還參與光合色素、蛋白質(zhì)、DNA 的合成和細胞分裂等多種代謝和生長過程［20］。單種營養(yǎng)鹽沒有辦法滿足微藻的正常生長，營養(yǎng)鹽對微藻的生長影響不是獨立的，而是相互作用的。通過正交試驗結(jié)果表明，錘狀中鼓藻培養(yǎng)效果最佳的礦質(zhì)元素組合為：NaNO3-N、NaH2PO4-P、FeSO4-Fe、Na2SiO3-Si和Na2MoO4質(zhì)量濃度分別為 20.0、1.0、0.1、15.0、0.02 mg/L。

3.5 維生素

維生素對微藻生長的影響因種類而異。宋邦興等［21］研究表明，翼繭形藻（Amphiprora alata）生長繁殖最適的維生素為0.1 mg/L VB1和0.05 mg/L VB12。季祥等［22］研究表明，擬微綠球藻（Nannochloropsis）生長繁殖最適的維生素為 0.005 mg/L VB1、0.00025 mg/L VB12和 0.00025 mg/L 生物素。本試驗結(jié)果表明，VB1和生物素的濃度分別為1.0和0.05 mg/L時，錘狀中鼓藻的培養(yǎng)效果最好。

［1］楊聽林，左正宏，林均民.中華盒形藻有性生殖過程中的光效應(yīng)和光受體［J］.海洋科學，2004，28（7）：44-48 .

［2］林均民，黃燦輝.中華盒形藻三類大小細胞的生化組成［J］.廈門大學學報（自然科學版），1994，33（5）：686-690.

［3］楊世民，董樹剛，吳以平.中國海域浮游硅藻鐘形中鼓藻初步研究［J］.海洋湖沼通報，2008（1）：54-57.

［4］Fabien J，Sebastien L，Benoit V，et al.Phytoplankton community structure and primary production in small intertidal estuarine-bay ecosystem（eastern English Channel，F(xiàn)rance）［J］.Mar Biol，2007，151（3）：805-825.

［5］Thillai K R，Rajkumar M，Sun J，et al.Bloom forming species of phytoplankton in two coastal waters in the Southeast coast of India［J］.Journal of Ocean University of China，2010，9（3）：265-272.

［6］Thillai R K，Rajkumar M，Sun J，et al.Seasonal variations of phytoplankton diversity in the Coleroon coastal waters，southeast coast of India［J］.Acta Oceanologica Sinica，2010，29（5）：97-108.

［7］錢樹本，劉東艷，孫軍.海藻學［M］.青島：中國海洋大學出版社，2005：384-397.

［8］郭玉潔，錢樹本.中國海藻志，第五卷，硅藻門，第一冊，中心綱［M］.北京：科學出版社，2003.

［9］成永旭.生物餌料培養(yǎng)學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

［10］倪海兒.生物試驗設(shè)計與分析［M］.北京：科學出版社，2013.

［11］Joel C G，Roger M.Temperature-influenced variations in speciation and chemical composition of marine phytoplankton in outdoor mass cultures［J］.J Exp Mar Biol Ecol，1980，46（1）：29-39.

［12］梁英 ，刁永芳 ，陳書秀 ，等.溫度對小新月菱形藻葉綠素熒光特性及生長的影響［J］.水產(chǎn)科學，2011，30（8）：435-440.

［13］曾蓓蓓，黃旭雄，危立坤，等.3種半咸水硅藻的適宜培養(yǎng)條件及其細胞生化成分［J］.海洋漁業(yè)，2014，36（4）：320-328.

［14］Zhang X C，Eric B，Maraianne P，et al.Effect of light flux density and its spectra quality on photosynthesis and respiration inPorphyra yezoensis（Bangiales，Rhodophyta）［J］.Phycological Research，1997，45（1）：29-37.

［15］王珺，賴秋明，姚發(fā)壯，等.人工培養(yǎng)條件下環(huán)境因子對微小小環(huán)藻生長繁殖的影響［J］.海洋漁業(yè)，2013，35（2）：195-201.

［16］王珺，王永強，陳國華，等.生態(tài)和營養(yǎng)條件對日本星桿藻生長的影響［J］.海洋漁業(yè)，2014，36（4）：329-334.

［17］王忠.植物生理學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［18］羅曉霞，劉錦上，李長玲.不同氮營養(yǎng)鹽濃度對斜生柵藻生長及化學組成的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2018，45（1）：64-69.

［19］梁晶晶，蔣霞敏，葉麗，等.氮、磷、鐵對三角褐指藻誘變株生長、總脂及脂肪酸的影響［J］.生態(tài)學雜志，2016，35（1）：189-198.

［20］Werner D.Silicate metabolism［M］.London：Black Well Scientific Publications，1977：110-149.

［21］宋邦興，王珺，陳國華，等.翼繭形藻培養(yǎng)基的篩選及優(yōu)化［J］.海洋漁業(yè)，2016，38（3）：297-303.

［22］季祥，喬巖，成杰，等.擬微綠球藻生長條件優(yōu)化［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（2）：154-156.