紅心杉組培苗增殖培養基的優化

韓吉思，方小榮，申禮鳳，李建波，姚 茜，楊 梅

（1.廣西大學林學院，廣西 南寧 530004；2.廣西國有高峰林場，廣西 南寧 530002）

近年來，杉木組織培養技術在工廠化育苗中已經得到一定范圍內的應用，但杉木人工造林仍以種子繁殖的實生苗為主，無性系幼苗在造林中的應用還較少，且杉木種子生產常受到氣候及大小年等因素的影響，導致優良種子的產量波動較大［1］，嚴重制約著杉木人工林的可持續經營。而利用無性繁殖技術可以在短時間內獲得大量遺傳基因型一致的優良苗木，既可以彌補杉木傳統育種的缺陷，又可以充分發掘優良遺傳材料的遺傳潛能，有利于商業化生產。很多科研人員在杉木組培方面做了大量探索，尤其在杉木愈傷組織培養、繼代培養、組培苗誘導生根等方面取得了長足進步［2-3］。韋如萍等［4］研究了植物生長激素對杉木組培苗增殖和生根的影響，結果表明以MS+NAA 0.05 mg/L + 6-BA 0.3 mg/L +瓊脂7 g/L +蔗糖30 g/L較適宜增殖培養，1/2MS + IBA 0.7 mg/L +瓊脂7 g/L +蔗糖25 g/L適宜生根培養。李峰卿等［5］對杉木組培體系進行優化，其增殖倍數達到4.19，同時發現去除頂芽的外植體較之帶頂芽的外植體在接種后增殖倍數有所提高。黃娟［6］研究指出，不同杉木外植體的表面滅菌效果存在明顯差異，0.1% HgCl2處理10 min有利于下胚軸、子葉、未成熟胚和莖段4種外植體的滅菌。徐圓圓［7］、周錦業［8］研究了復配LED光質對杉木組培苗的影響，指出不同光質和光周期會產生不同效應。

紅心杉〔Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.〕是杉木的特殊變異類型，屬杉科杉屬植物，喜生于氣候溫暖、降雨量多、濕度大、光照時間短的陰涼山區，具有抗逆性高、適應性強、生長快、樹干圓直、紋理細密、堅韌耐腐等特征，且紅心比率高、色澤獨特、芳香，廣泛分布于我國亞熱帶地區［9-10］。已有學者在紅心杉組培方面進行了研究，如江香梅等［11］以紅心杉優良無性系基部萌條為外植體建立了組培高效繁育體系。陳振科等［12］以紅心杉優良單株組培苗為材料，研究了不同植物生長調節劑對組培苗生長和內源激素含量的影響。本試驗將基本培養基、細胞分裂素苯基噻二唑基脲（TDZ）濃度及天然復合物香蕉汁濃度進行搭配組合，篩選最優的紅心杉組培苗增殖培養條件，以期為進一步優化紅心杉組培技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅心杉組培外植體材料取自廣西賀州市八步區16年生紅心杉林分的優樹，以在廣西大學組培室繼代培養的第12代生長一致的組培繼代瓶苗為試驗材料。

1.2 試驗方法

采用正交試驗設計，選用基本培養基、TDZ濃度、香蕉汁濃度3個因素。其中，基本培養基設MS、3/4MS和1/2MS 3個處理，TDZ濃度設0、0.2、0.4 mg/L 3個水平，香蕉汁濃度設0、100、200 g/L 3個水平（表1）。各因素隨機排列，進行正交試驗。香蕉汁制備方法是按不同試驗設計分別稱取所需的香蕉量（質量體積比，W/V），搗爛后放入燒杯中，加入500 mL蒸餾水，置于電爐上加熱至沸騰，然后用微火保持微沸20～30 min，過濾，去渣取汁作配制培養基用［13］。

表1 L9（34）正交試驗設計因素水平

根據表1配制9個處理的培養基，分裝至培養瓶，每瓶40 mL，貼好標簽，連同用報紙包裹好的鑷子、解剖刀、不銹鋼盤、蒸餾水等置于高壓蒸汽滅菌鍋，121℃下滅菌，接種環境以紫外燈滅菌30 min，酒精擦拭超凈工作臺。在超凈工作臺上，將無菌發芽的健壯組培苗切除愈傷組織后切成約1.5 cm的莖段，接種于培養基上，每瓶6個莖段，每個處理3次重復，每個重復接種15瓶。將接種好的材料置于光照培養室中，培養溫度24（±3）℃、光周期12 h/d、光照強度1 500 lx，30 d后統計組培苗的葉芽數并計算其增殖系數，準確稱取杉木組培苗葉片并剪碎，測定葉綠素和可溶性糖含量。其中，增殖系數=總芽數/接種時芽數，葉綠素含量采用丙酮乙醇提取法［14］測定，可溶性糖含量采用蒽酮濃硫酸法［15］測定。

1.3 數據統計分析

所有數據采用Excel 2007軟件處理并進行極差分析，采用SPSS軟件［16］對數據進行單因素方差分析和Duncan多重比較。由于各指標在不同處理間的表現存在差異，單一指標難以全面客觀地反映不同植物生長調節劑的育苗效果［17］，因此，本試驗采用多維空間（歐幾米德）En綜合評定法對各處理培養基進行綜合評價［18］，以避免指標間相關性的影響和覆蓋。具體方法如下：將所需評定的3個指標按9個處理列出原始數據表；在每一指標中選出最大值作標準值，并令其等于1，再將這一指標其他數值除以該指標中的最大值，所得的商填入矩陣坐標表；通過以下公式計算矩陣坐標表中各列數值與其他標準值商的離差平方和：

2 結果與分析

2.1 不同培養基對紅心杉組培苗增殖系數的影響

從表2可以看出，在2號培養基（A1B2C2）中，紅心杉組培苗的增殖系數最高、達2.72，顯著高于其他處理，增殖系數最低的是8號培養基（A3B2C1）、僅1.72，前者是后者的1.6倍。各因素對增殖系數影響的大小表現為基本培養基＞香蕉汁濃度＞TDZ濃度，紅心杉組培苗的增殖系數隨著基本培養基濃度的增加呈上升趨勢，適量濃度的TDZ和香蕉汁對增殖培養都有一定的促進作用，但是濃度過大時反而有抑制作用。

表2 不同培養基對紅心杉組培苗增殖系數的影響

2.2 不同培養基對紅心杉組培苗葉綠素含量的影響

由表3可知，紅心杉組培苗在7號培養基（A3B1C3）中葉綠素含量最高（2.53 mg/g），顯著高于除4號外的其他培養基處理，是葉綠素含量最低的2號培養基（A1B2C2、1.71 mg/g）的1.5倍。影響紅心杉組培苗葉綠素含量的3個因素依次為基本培養基＞TDZ濃度＞香蕉汁濃度。TDZ和香蕉汁濃度提高時葉綠素含量呈上升趨勢。

2.3 不同培養基對紅心杉組培苗可溶性糖含量的影響

紅心杉組培苗可溶性糖含量最高的處理是1號培養基（A1B1C1）、為33.84 mg/g，與6號、7號、8號、9號培養基存在顯著差異，最低的9號培養基（A3B3C2）的可溶性糖含量僅20.68 mg/g（表4）。對紅心杉組培苗可溶性糖含量的影響大小表現為基本培養基＞TDZ濃度＞香蕉汁濃度。基本培養基和香蕉汁濃度增加時可溶性糖含量都呈上升趨勢，TDZ濃度增加時可溶性糖含量呈下降趨勢。

表3 不同培養基對紅心杉組培苗葉綠素含量的影響

表4 不同培養基對紅心杉組培苗可溶性糖含量的影響

2.4 不同培養基對紅心杉組培苗增殖效果的坐標綜合評定

從表5可以看出，在9個處理中，4號培養基的紅心杉組培苗各個指標都處于較高水平、增殖效果最好，∑Pi2值為0.0108；5號培養基效果第二；2號培養基對組培苗增殖系數的作用最好；7號培養基對葉綠素含量的影響最佳；1號培養基對可溶性糖含量的影響最佳。綜合評定認為，紅心杉組培苗的最佳增殖培養條件為3/4MS+香蕉汁100 g/L。

3 結論與討論

本試驗結果表明，不同培養基組合下紅心杉組培苗的增殖系數、葉綠素含量、可溶性糖含量相差較大。培養基在植物生長過程中起到不可替代的營養物質成分，也是影響次生代謝產物合成的關鍵因素之一［19］，植物組織培養成功與否，一方面取決于培養材料自身的性質，另一方面也取決于培養基的種類和成分，不同的植物材料對培養基的要求不同，因而必須根據植物材料和培養目的的不同選擇合適培養基，并按照不同的培養階段加入適當的添加物。

表5 不同培養基對紅心杉組培苗增殖效果的坐標綜合評定

MS培養基是組培技術應用最廣泛的培養基質，具有較高的増殖效果［20］。莫雅芳等［21］以杉木優良樹種基部莖段為材料，在1/2MS+IBA 0.3 mg/L+6-BA 0.4 mg/L中培養25 d后腋芽增殖倍數較高。楊家鴻［22］研究認為，MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.3 mg/L適宜紅心杉誘導培養。呂杰等［23］在研究基因型及基本培養基對玉米成熟胚培養的影響時發現，MS培養基更適合多數基因型的玉米愈傷組織的誘導培養。秦獻泉等［24］以荔枝和龍眼莖段為外植體培養發現，MS培養基更適合荔枝和龍眼莖段芽的誘導。姜殿強等［25］研究表明，對鐵皮石斛莖段叢生芽的增殖培養而言，MS培養基優于1/2MS、B5和N6培養基。本研究也發現，基本培養基是影響紅心杉組培苗增殖培養的最主要因素，而3/4MS+香蕉汁100 g/L培養基更適合紅心杉組培增殖。

適宜濃度的激素既有利于愈傷組織不定芽的形成，又會促進不定芽的生長發育［26］。因此，組培苗繼代增殖過程中，掌握激素的使用種類及濃度具有重要意義。韋如萍等［27］研究發現，MS+NAA 0.05 mg/L適宜杉木的增殖培養；黃碧華［28］對杉木組培苗研究時得出1/2MS+6-BA 0.8 mg/L最適宜杉木的增殖培養。本試驗也發現，適宜濃度的TDZ對紅心杉組培苗增殖具有促進作用。黃卓輝等［29］認為TDZ能有效影響與細胞分化有關的各種酶的活性，從而影響植株生長。康大力等［30］研究結果表明，TDZ在喜樹愈傷組織培養中可替代植物激素并對細胞植物色素積累有明顯影響。崔瑾等［31］認為，TDZ能有效誘導芋莖尖的萌動、生長，促進大量叢生芽增殖和組培苗根系發生，提高馴化成活率，這也證實了本研究中TDZ對葉綠素含量和增殖的影響。在組織培養中還經常使用到椰汁、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、馬鈴著汁等天然有機添加物［32］，這些有機添加物汁液中含有氨基酸、激素、酶和一些化學成分不明的有機物，其營養豐富但不穩定，是復雜的營養混合物，主要作用是為植物生長提供一些生理活性物質，補充一些未知的微量成分［33］。有研究表明，一定濃度的香蕉泥有利于鐵皮石斛組培原球莖的分化，提高分化率［34］，有效提高鐵皮石斛莖段和組培苗叢生芽的増殖系數［35］；添加香蕉汁適宜帶葉兜蘭叢生芽的誘導和增殖培養［36］。在本研究中，雖然香蕉汁對紅心杉組培苗各項指標的影響不是最主要的，但是隨著香蕉汁濃度的增加，紅心杉組培苗的葉綠素、可溶性糖含量都有所提高，這可能與香蕉汁富含有機成分，對植株鮮重、株高和莖粗等的生長起到促進作用有關［37］，而葉綠素含量高有益于組培苗的增殖和生長［38-39］。郎賢波［40］研究豐滿紅樹莓組培快繁時指出，可溶性糖含量對組培苗增殖具有促進作用。由于香蕉汁中含有激素等成分，所以在與TDZ配合使用時應進一步優化紅心杉及其他杉木品種組培不同階段的使用濃度，并探討其對組培苗后期生長質量的影響。

組培是一個復雜繁瑣的過程，培養基成分是影響組培成功與否的關鍵因素，而外源添加物種類和濃度的選擇將會大大提高植物組培在誘導、增殖、生根等過程的成功率。紅心杉的組培技術已取得一些進展，但多數研究集中于培養基選擇、激素濃度等方面，在天然復合物應用研究方面還較少，而復合物在經濟性上占很大優勢，今后可在復合物種類、濃度方面進一步優化，以提高增殖率及芽苗質量，并在后續工作中探討提高組培苗生根率的方法，達到紅心杉組培快繁的目的。

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