5406放線菌培養條件的優化試驗

李 麗 楊 倩 邢 力 秦秀麗

（吉林農業科技學院 吉林市 132101）

5406放線菌又稱細黃放線菌（Actinomyces microflavus），在代謝過程中能夠產生次級代謝抗菌素、生長素以及細胞分裂素等生物活性物質，能夠刺激種子生根、發芽，對土著性病原菌具有較好的抑菌作用，減少種子受病害侵害，使土壤中無效磷、鉀得到轉化[1-2]。因此能促進作物生長，防止作物及果蔬枯萎病、白粉病等多種病害的發生，提高作物及果蔬的品質及產量[3-4]，是具有解鉀、解磷、抗病、促生、保苗等多功能的抗生菌肥[5-6]，在綠色農業生產中具有較好的應用前景。目前培養5406放線菌試管菌種常用高氏1號培養基，由于長期使用該培養基以及對其生長的環境條件不甚了解，在5406放線菌培養過程中常發生菌絲生長慢、甚至停止生長，雜菌污染嚴重問題等，針對這些問題本試驗對培養5406放線菌常用的高氏1號加富培養基以及生長的環境條件進行研究，對高氏1號加富培養基配方及生長的環境條件進行了優化，為5406放線菌菌種培養及菌肥的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：5406放線菌試管菌種由吉林農業科技學院生物工程學院微生物實驗室提供。

1.1.2 供試藥劑：葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2S04、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、NaCL、瓊脂、NaOH、維生素 B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素B12均為分析純。

1.1.3 培養基

1.1.3.1 菌種活化培養基：以高氏1號培養基為基礎培養基及菌種活化培養基。其配方為可溶性淀粉20g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCl 0.5g、瓊脂 18g、H2O 1000mL、pH為7.2。

1.1.3.2 供試培養基：以高氏1號培養基為基礎培養基，分別添加10g葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖等供試碳源至，配制供試高氏1號碳源加富培養基。

以高氏1號培養基為基礎培養基，分別添加10g酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2SO4等供試氮源，配制供試高氏1號氮源加富培養基。

維生素供試培養基：以高氏1號培養基為基礎培養基，分別添加0.2g維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12等供試維生素，配制供試高氏1號維生素加富培養基。

1.1.4 主要設備及用具

超凈工作臺（SW-CJ-2FD型，上海新苗醫療器械）；高壓蒸汽鍋（MLS-3781L-CP型，松下醫療器械）；生化培養箱（HPS-280型，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司）；智能培養箱（PGX-350A型）；電子天平（BSA224S-CW型，賽多利斯科學儀器）；游標卡尺；分析天平；移液槍等。

1.2 方法

1.2.1 供試菌種的活化

配制高氏1號基礎試管培養基，在無菌條件下，用接種環從5406放線菌母種中挑取少許菌絲及孢子，試管培養基上劃線接種，27℃恒溫培養7天，選取菌落表面干燥、堅實多皺、菌絲潔白、致密的試管作為供試菌種，制備成104/mL孢子懸浮液。

1.2.2 高氏1號加富培養基（碳源、氮源、維生素）單因素試驗

在高氏1號基礎培養基按1.1.3.2分別加入供試碳源、氮源、維生素制備平板培養基，每個平板中接104/mL孢子懸浮液0.1mL，每個因素接20個平板，在27℃恒溫培養7天，觀測菌絲的長勢以菌落直徑[7]，確定高氏1號加富培養基中適宜的碳源、氮源、維生素。

1.2.3 高氏1號加富培養基最適配方的確定

根據1.2.2單因素試驗結果，以篩選出的適宜碳源、氮源、維生素、pH為試驗因素，設計L9（34）正交試驗[8]（設計見表1），配制9種高氏1號加富培養基，每個試驗組接20個平板。在27℃恒溫培養7天，觀測菌絲的長勢以菌落直徑，確定高氏1號加富培養基最佳組合。

表1 L9(34)營養液正交試驗因素及水平

1.2.4 5406放線菌生長環境條件的單因素試驗

1.2.4.1 5406放線菌生長適宜溫度的確定：按照優化出的高氏1號加富培養基最適配方制作平板培養基，每個平板中接104/mL孢子懸浮液 0.1mL，分別放置于 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃生化培養箱中在無光條件下培養7天，每個水平接20個平板，觀測菌絲的長勢以菌落直徑，確定5406放線菌生長的適宜的溫度條件。

1.2.4.2 5406放線菌生長適宜光照條件的確定：按照優化出的高氏1號加富培養基最適配方制作平板培養基，每個平板中接104/mL 孢子懸浮液 0.1mL，分別放置于無光、100Lx、200Lx、300Lx、500Lx條件下，在最適溫度下進行培養7天。每個水平接20個平板，觀測菌絲的長勢以菌落直徑，確定5406放線菌生長的適宜的光照條件。

1.2.4.3 5406放線菌生長適宜空氣相對濕度的確定：按照優化出的高氏1號加富培養基最適配方制作平板培養基，每個平板中接104/mL孢子懸浮液0.1mL，分別放置于空氣濕度為40%～50%、50%～60%、60%～70%、70%～80%條件下，在最適溫度和光照條件下進行培養7天。每個水平接20個平板，觀測菌絲的長勢以菌落直徑，確定5406放線菌生長的適宜的光照條件。

2 結果與分析

2.1 高氏1號加富培養基（碳源、氮源、維生素）單因素試驗結果

2.1.1 高氏1號碳源加富培養基的篩選

圖1 5406放線菌在高氏1號不同碳源加富培養基上生長情況

試驗結果見圖1。試驗結果表明，在高氏1號基礎培養基中添加不同的供試碳源5406放線菌菌絲生長速度的影響是不同的。從圖1中可以看出5406放線菌在添加麥芽糖加富培養基上菌絲生長最快，接種7天后菌落直徑達到6.35mm，比對照培養基上菌落直徑大2.73mm，觀察菌落表面特征，菌絲呈白色，致密；其次是在蔗糖和葡萄糖加富培養基上生長較快，菌落直徑分別比對照培養基上菌落直徑大1.84mm和1.56mm，菌落表面白色，較致密；以乳糖為碳源加富培養基上菌落生長速度最慢，接種7天后菌落直徑達到4.54mm，比對照培養基上的菌落直徑大0.92mm，菌落表面白色，較致密。因此，通過試驗篩選出高氏1號碳源加富培養基為麥芽糖，其次為蔗糖和葡萄糖，生長最慢的為乳糖。

2.1.2 高氏1號氮源加富培養基的篩選

圖2 5406放線菌在高氏1號不同氮源加富培養基上生長情況

試驗結果見圖2。試驗結果表明，在高氏1號基礎培養基中添加不同供試氮源，對5406放線菌菌落生長速度的影響是不同的。從圖2中可以看出5406放線菌在添加牛肉膏氮源加富培養基上菌絲生長最快，接種7天后菌落直徑達到6.16mm，比對照培養基上菌落直徑大2.54mm，觀察菌落表面特征，菌絲呈白色，致密；其次是在蛋白胨和酵母膏氮源加富培養基上生長較快，菌落直徑分別比對照培養基上菌落直徑大1.60mm和1.55mm，菌落表面白色，較致密；在（NH4）2SO4氮源加富培養基上菌落生長速度最慢，與對照相近，接種7天后菌落直徑達到3.86mm，只比對照培養基上的菌落直徑大0.24mm。因此，通過試驗篩選出高氏1號氮源加富培養基為牛肉膏，其次為蛋白胨和酵母膏藥，而（NH4）2SO4氮源加富培養基生長上菌落生長最慢。

2.1.3 高氏1號維生素加富培養基的篩選

圖3 5406放線菌在高氏1號不同維生素加富培養基上生長情況

試驗結果見圖3。試驗結果表明，在高氏1號基礎培養基中添加不同供試維生素，5406放線菌菌落生長速度的影響是不同的。從圖3中可以看出，5406放線菌在添加VB1加富培養基上菌落生長最快，接種7天后菌落直徑達到6.24mm，比對照培養基上菌落直徑大2.62mm，觀察菌落表面特征，菌絲呈白色，致密；其次是在VB12加富培養基上生長較快，菌落直徑分別比對照培養基上菌落直徑大2.25mm，在VB6加富培養基上菌落直徑比對照培養基上菌落直徑大1.84mm；在VB2加富培養基上菌落生長速度最慢，比對照培養基上菌落直徑大1.23mm；因此，通過試驗篩選出高氏1號維生素加富培養基為VB1，其次為VB12，在VB2加富培養基生長上菌絲生長最慢。

2.2 高氏1號加富培養基最適配方的確定

試驗結果見表3。由表3可知，不同組合之間5406放線菌菌落生長速度是不同的，以A3B2C1D3組合放線菌菌落的生長速度最快，菌落的平均直徑為6.64mm，菌落表面為白色，菌落表面致密，長勢好。從極差分析結果可以看出，對5406放線菌生長速率影響的排序為麥芽糖＞pH＞VB1＞牛肉膏，通過試驗確定高氏1號加富培養基最適配方為可溶性淀粉20g、麥芽糖15g、牛肉膏4g、B120.1g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCL0.5g、瓊脂 18g、H2O1000mL、pH 為 7.5。

表3L9（34）正交試驗結果

2.3 5406放線菌生長環境條件的單因素試驗結果

2.3.1 5406放線菌生長適宜溫度的確定

圖4 不同溫度對5406放線菌生長的影響

試驗結果見圖4。由圖4可知，5406放線菌菌落隨著溫度的升高，生長速度逐漸加快，在35℃下生長速度最快，培養7天菌落直徑達6.35mm，菌落表面白色致密，長勢好，當超過35℃時，生長速度逐漸下降，當溫度達到45℃時，培養7天的菌落直徑為3.24mm，菌落表面菌絲稀疏，長勢差。由此可知，5406放線菌生長的適宜溫度為35℃。

2.3.2 5406放線菌生長適宜空氣相對濕度的確定

圖5 不同空氣相對濕度對5406放線菌生長的影響

試驗結果見圖5。由圖5可知，5406放線菌菌落隨著空氣相對濕度的升高，生長速度逐漸加快，當空氣相對濕度達到60%時，生長速度最快，培養7天菌落直徑達6.54mm，菌落表面白色致密，長勢好；當空氣濕度超過60%時，菌落的生長速度逐漸下降，特別是空氣濕度達到80%時，平板培養基污染較重，表明5406放線菌不宜在高濕條件下培養，最適的空氣相對濕度為60%左右。2.3.3 5406放線菌生長的適宜光照條件的確定

試驗結果見圖6。由圖6可知，5406放線菌菌落在無光或弱光條件生長速度較快，隨著光照的增強，生長速度逐漸下降。觀察菌落表面特征，在無光或弱光條件下菌落致密，較厚，長勢好；當光照達到300Lx后，菌落薄，長勢較差。

圖6 不同光照強度對5406放線菌生長的影響

3 結論與討論

3.1 在高氏1號碳源加富培養基的篩選試驗中，從理論上看葡萄糖作為單糖要比雙糖更容易被吸收，但本研究中在高氏1號基礎培養基中加入麥芽糖為速效碳源時，5406放線菌菌落生長速度最快，長勢最好，說明麥芽糖更易于5406放線菌吸收利用；進行高氏1號氮源加富培養基篩選時，試驗結果證明有機氮源有利于5406放線菌吸收和利用，特別是牛肉膏氮源加富培養基，菌落的生長的較快，長勢好，而在高氏1號基礎培養基中加入無機氮源（NH4）2SO4時，菌落的生長速度與對照相近，說明5406放線菌對無機氮源吸收利用不充分；在高氏1號維生素加富培養基篩選試驗中，添加不同的維生素時5406放線菌與對照相比較均有促進作用，添加VB1和VB12時效果最佳。

3.2 試驗結果表明，所用的高氏1號加富培養基與高氏1號基礎

培養基（對照）相比，均能夠促進5406放線菌的生長，但通過正交試驗篩選出適合5406放線菌生長的高氏1號加富培養基配方為可溶性淀粉20g、麥芽糖15g、牛肉膏4g、B10.1g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCL 0.5g、瓊脂 18g、H2O1000mL、pH為7.5。該配方與高氏1號基礎培養基相比，營養更充分，更有利于5406放線菌的生長。

3.3 5406放線菌生長不僅需要充足的營養條件，還需要適宜的環境條件。為了確定5406放線菌生長適宜的環境條件，本試驗對溫度、光照、空氣相對濕度進行了單因素試驗研究。試驗結果表明，5406放線菌生長適宜的環境條件為適宜溫度為35℃，適宜的空氣相對濕度為60%左右，在無光或弱光條件下生長快，菌落較厚，表面致密，長勢好。

[1] 崢嶸.5406放線菌對小麥幼苗的影響[J].內蒙古農業大學學報(自然科學版），2006，（02）：150-152.

[2] 張彥麗，谷思玉，曾祥書.低磷土壤接種微生物壯秧劑對水稻秧苗吸收氮磷鉀的影響[J].中國農學通報，2007，（07）:370-374.

[3] 孟煥文，程智慧，冀瑞瑞.放線菌劑和種衣劑對西瓜防病壯苗的效果[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2007，（08）：109-113+120.

[4] 孫敬祖，薛泉宏，唐明.放線菌制劑對連作草莓根區微生物區系的影響及其防病促生作用[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2009，37（12）:153-158.

[5] 李智.5406抗生菌肥特性及使用方法[J].生物加工過程，2003，（02）：50-52.

[6] 朱宏建，易圖永，周鑫鈺.土壤放線菌生防活性物質的研究進展[J].作物研究，2007，（02）：149-151.

[7] 孫磊，程顯好，李維煥.菌落直徑法和菌絲干重法在優化真姬菇菌種固體斜面培養條件的比較[J].中國食用菌，2015，34（03）：28-32.

[8]王玄靜.正交試驗設計的應用及分析 [J].蘭州文理學院學報（自然科學版）2016，30（01）：17-22.