小麥HMW-GS毛細管電泳高效分離體系研究

王衛東，高 翔,2，何慶夢，姚曉露，劉 陽，楊明明,2，李建芳,2，楊 娜

(1.西北農林科技大學農學院，陜西楊陵 712100；2.陜西省小麥工程技術研究中心，陜西楊凌 712100；3.山西省農業科學院棉花研究所，山西運城 044000)

小麥(TriticumaestivumL.)貯藏蛋白主要包括醇溶蛋白和谷蛋白兩大類，依據分子量大小可將谷蛋白進一步分為高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)[1]。其中，HMW-GS與面筋彈性和延展性密切相關，是參與形成谷蛋白多聚體的主要成分[2]；HWM-GS的組合不同則產生的品質效應不同[3]。對小麥品種中HMW-GS的分離鑒定已成為品質研究的重要環節。

傳統方法分離小麥HMW-GS多采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)和高效液相色譜(HPLC)等[4-7]。SDS-PAGE分離所需時間較長，對樣品需求量較大，分離效果容易受環境及人為因素影響，且在鑒定亞基類型時需要對照“Payne命名系統”，準確性低，一些遷移率接近的亞基難以被區分。雖然結合分子標記技術可以在一定程度上彌補這一缺點，但由于特異性引物種類有限、實驗前需要對種子發苗、提取和純化樣品DNA等，工作效率較低。HPLC較 SDS-PAGE方法克服了很多不足，但其成本較高，適用范圍窄。HPCE(毛細管電泳)技術以其進樣少、運行成本低、快速、準確性高等特點，被越來越多地應用于小麥HMW-GS研究[8-11]。

HPCE中，分離介質緩沖液的選擇至關重要。目前，應用于小麥貯藏蛋白分離的常規HPCE緩沖系統主要包括磷酸鹽緩沖液系統、硼酸鹽緩沖液系統、乳酸鋁緩沖液系統及Prosot SDS。Bietz[12]最早將酸性磷酸鹽緩沖液與堿性硼酸鹽緩沖液引入到HWM-GS的HPCE中，并獲得了較好的分離效果。Werner等[13]首次使用乳酸鋁緩沖液分離小麥HMW-GS，并成功鑒定了多個品種的亞基組成，之后又以Prosort SDS為緩沖劑對HMW-GS相關特性進行了研究[14]。Sutton等[15]在Prosot SDS中加入5%甲醇，對HMW-GS的HPCE鑒定圖譜進行了研究。Bean等[16]使用Phos-gly(磷酸-甘氨酸)緩沖液對HMW-GS進行HPCE電泳分離，相比前人獲得了更好的分辨率及分離效果。

上述應用于小麥HMW-GS分離的HPCE緩沖液系統，雖然具有較好的分離效率，但重現性較差，對亞基的定性分析尚顯不足，不利于亞基標準鑒定圖譜的構建。本試驗以普通小麥中國春為標準樣，引入亞氨基二乙酸(IDA)緩沖液系統[17]，擬通過研究毛細管電泳中不同緩沖液組分濃度、緩沖液pH、分離電壓、進樣時間、運行溫度、毛細管內徑等對亞基分離的影響，確立小麥HMW-GS的HPCE高效分離體系，并通過連續重復試驗、混合進樣分析對體系的分離效率及重現性進行驗證，以期為HPCE定性分析及標準鑒定圖譜的構建提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥品種中國春、石4185、陜182，由國家小麥改良中心楊凌分中心品質實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 小麥HMW-GS的提取

參照文獻[7]的方法并作改進：將單粒種子研磨成粉后加1 mL 70%乙醇振蕩30 min，20 ℃ 13 000 r·min-1離心10 min，棄上清液；向沉淀中加入1 mL提取液A(50%異丙醇)，混勻，60 ℃水浴30 min；室溫下13 000 r·min-1離心10 min，棄上清，重復此步驟2次。向沉淀中加入150 μL提取液B[50%異丙醇+3 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.8)+25 g·L-1二硫蘇糖醇]，混勻后60 ℃水浴30 min。加入150 μL提取液C[50%異丙醇+3 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.8)+10 g·L-14-乙烯基吡啶]，65 ℃繼續水浴1 h。將水浴后產物于20 ℃ 13 000 r·min-1離心15 min，取120 μL上清液，加入80 μL預冷(-20 ℃)的丙酮溶液，使丙酮占總體積的40%。將混合液于-20 ℃冰箱中沉淀過夜，20 ℃ 13 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，所得沉淀即為HMW-GS。

1.2.2 毛細管電泳系統運行前后處理

將1.2.1所得的蛋白沉淀烘干，加入200 μL蛋白溶解液(每50 mL含：15 mL丙三醇+18 g尿素+75 μL乙酸)，于35 ℃水浴溶解1 h，-20 ℃保存備用，使用前超聲脫氣。與毛細管電泳相關的緩沖液及沖洗試劑均由超純水配置，經0.45 μm濾膜過濾，20 ℃、50 W超聲脫氣15 min。

電泳分離前的沖洗程序為：N2反向吹干1 min，1 mol·L-1H3PO4沖洗2 min，0.1 mol·L-1NaOH沖洗2 min，去離子水沖洗1 min，緩沖液沖洗3 min。實驗結束后用0.1 mol·L-1NaOH沖洗2 min，反向去離子水沖洗1 min。

1.2.3 毛細管電泳分離體系的優化

使用P/ACE MDQ plus毛細管電泳儀(Beckman，USA)對樣品進行分析。毛細管配置為檢測長度27 cm的石英非涂層毛細管(USA)。IDA緩沖液組分為：IDA(亞氨基二乙酸)+HPMC(羥丙基甲基纖維素)+ACN(乙腈)。利用控制變量法，對緩沖液系統及電泳分離參數進行逐一優化，確立HMW-GS毛細管分離最佳體系。緩沖液系統pH設置為2.2、2.5、2.8；緩沖液組分中IDA濃度設置為50、75、100 mmol·L-1；HPMC濃度設置為0、0.05%、0.5%；ACN濃度設置為10%、15%、20%。電泳參數中，分離電壓設置為15、20、25 kV；運行溫度設置為25、30、35 ℃；毛細管內徑設置為25、50 μm；進樣時間設置為5、8 s。

1.2.4 HMW-GS毛細管電泳分離體系重現性驗證

利用構建好的HPCE高效分離體系，對小麥品種中國春的HMW-GS進行連續30次及連續多天電泳分離，檢驗毛細管電泳圖峰形、基線穩定性。將中國春與石4185、陜182混合進樣，比較該體系與常規Phos-gly/ACN體系(磷酸-甘氨酸+HPMC+ACN)的分離效率及圖譜分辨率，計算各亞基出峰時間的RSD值，驗證分離重現性。

2 結果與分析

2.1 緩沖液系統pH的選擇

依據Salmanowicz等[18]、Yan等[19]的研究，毛細管電泳分離圖譜中，中國春的HMW-GS具有四個特征峰，按遷移時間順序分別為1Dy12→1By8→1Bx7→1Dx2。由圖1可知，在緩沖液為100 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+20% ACN，采用25 μm內徑毛細管，214 nm檢測波長，分離電壓15 kV，運行溫度25 ℃，10.0 kV電進樣5 s條件下，緩沖液pH對HMW-GS峰高、峰寬及基線均有顯著影響。pH為2.8時，8.13 min出現1Dy12亞基主峰；1By8主峰出峰時間為9.97 min，峰高較低，主峰辨別度差，且峰后有基線的波動；1Bx7主峰出峰時間為11.54 min；1Dx2主峰出現在13.12 min；從1Dy12到1Dx2亞基峰時間跨度為4.99 min；整體上看基線有明顯的上升趨勢。pH為2.5時，四個主峰出峰時間分別為10.24、11.94、13.40和15.00 min；相比pH2.8時出峰時間較晚，時間跨度稍有減小(4.76 min)，但整體峰形對稱、分離度較高、基線相對平穩。pH為2.2時，四個主峰出峰時間為11.57、12.55、14.31和16.08 min，時間跨度為4.51 min；相比pH為2.5、2.8，峰寬度增大、分離度降低；而且在臨近1Dy12亞基主峰時基線波動較大，1By8主峰與1Bx7主峰之間也出現了類似現象。說明pH為2.5時亞基分離效果較好。

A、B、C曲線所對應的pH分別為2.8、2.5、2.2。

The corresponding pH of A,B and C curves are 2.8,2.5 and 2.2,respectively.

圖1不同pH緩沖液對HMW-GS電泳分離的影響

Fig.1EffectofdifferentpHofbufferonelectrophoresisseparationofHMW-GS

2.2 緩沖液系統組分濃度的選擇

2.2.1 IDA濃度的選擇

如圖2所示，緩沖液為：0.05% HPMC+20% ACN，pH 2.5。電泳條件為：毛細管內徑25 μm，檢測波長214 nm，分離電壓15 kV，運行溫度25 ℃，10.0 kV進樣5 s，中國春的HMW-GS亞基整體遷移速率隨IDA濃度的增大而加快，濃度對亞基峰高、峰形及基線狀況影響不大。比較相同IDA濃度下連續兩針的電泳圖譜發現，IDA濃度對電泳分離重現性的影響較大。IDA濃度為50 mmol·L-1時，亞基遷移速率最慢，電泳第一針與第二針之間的出峰時間差異最大。IDA濃度為100 mmol·L-1時，亞基遷移最快，連續兩針間電泳出峰時間差值減小，但仍然較大，且在1Dy12主峰之前出現了基線的波動。IDA濃度為75 mmol·L-1時，亞基遷移速率介于50和100 mmol·L-1之間，兩針間電泳出峰時間幾乎重合，亞基峰形、基線均保持較高的一致性，電泳分離重現性較高。說明IDA濃度為75 mmol·L-1的亞基分離效果較好。

A和B、C和D、E和F曲線分別表示IDA濃度為100、75、50 mmol·L-1時電泳第一針、第二針。

A and B,C and D,and E and F represent the first and second electrophoresis when the concentration of IDA was 100 mmol·L-1,75 mmol·L-1and 50 mmol·L-1,respectively.

圖2不同IDA濃度對HMW-GS電泳分離的影響

Fig.2EffectofdifferentconcentrationofIDAontheelectrophoresisseparationofHMW-GS

2.2.2 HPMC濃度的選擇

如圖3所示，緩沖液為75 mmol·L-1IDA+20% ACN，pH 2.5。電泳條件為：毛細管內徑25 μm，檢測波長214 nm，分離電壓15 kV，運行溫度25 ℃，10.0 kV進樣5 s。HPMC濃度對HMW-GS分離度及基線狀況有顯著影響。不添加HPMC時，亞基遷移速度最快，但峰之間未完全分離，主峰界線不明顯，且峰形不規則。HPMC濃度為0.5%時，峰寬明顯變窄，亞基分離度最高，但基線噪音較大，影響了圖譜的分辨率。HPMC濃度為0.05%時，1Dy12、1By8、1Bx7、1Dx2四個主峰出峰時間分別為12.40、14.07、15.54和17.16 min，亞基分離度介于0與0.5%濃度之間，雖然亞基遷移速率降低，但主峰峰形對稱，且基線噪音很小，圖譜分辨率高。說明HPMC濃度為0.05%時最佳。

2.2.3 ACN濃度的選擇

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05 % HPMC，pH 2.5，毛細管內徑25 μm，檢測波長214 nm，分離電壓15 kV，運行溫度25 ℃，10.0 kV進樣5 s。添加不同濃度ACN，對HMW-GS毛細管電泳分離的影響主要集中在主峰分離度上(圖4)。ACN濃度為20%時，四個主峰分離度最低。ACN濃度為10%時，主峰分離度最大，但是峰寬增大、峰高明顯降低，即亞基縱向擴散與峰展寬比例減小，影響圖譜的分辨率。當ACN濃度為15%時，主峰分離度介于前兩者之間，1Dy12、1By8、1Bx7、1Dx2主峰依次出現在12.68、14.32、16.80和18.94 min，亞基峰形清晰對稱，基線噪音最低。因此，ACN濃度為15%最佳。

A、B、C曲線分別對應HPMC濃度0.5%、0.05%、0。

A,B and C curves correspond to 0.5%,0.05% and 0 of HPMC,respectively.

圖3不同HPMC濃度對HMW-GS電泳分離的影響

Fig.3EffectofdifferentconcentrationofHPMConthe

electrophoresisseparationofHMW-GS

A:20% ACN; B:15% CAN; C:10% ACN.圖4 不同ACN濃度對HMW-GS電泳分離的影響Fig.4 Effect of different concentration of ACN on theelectrophoresis separation of HMW-GS

2.3 毛細管電泳分離條件的選擇

2.3.1 毛細管分離電壓的選擇

利用已經優化好的IDA緩沖液系統，對毛細管電泳運行參數進行逐步優化，進一步提高HMW-GS分離效果。

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH為2.5；毛細管內徑25 μm，檢測波長214 nm，運行溫度25 ℃，10.0 kV進樣5 s。如圖5所示，當分離電壓為15 kV時，基線水平、亞基分離度較高，但是峰高相對較低，且遷移速度最慢。當電壓增大為20 kV時，主峰分離度未受明顯影響，與15 kV差異不大，亞基峰高明顯增大、整體遷移速率明顯加快，圖譜分辨率得到了提升。電壓達到25 kV時，雖然獲得了最大遷移速率及峰高，但是基線出現了整體下降的趨勢。由此可見，分離電壓的提高對遷移速率及峰高有促進作用，但會增加分離不穩定因素。綜合來看，20 kV分離電壓對HMW-GS的分離效果最佳。

A:15 kV; B:20 kV; C:25 kV.圖5 分離電壓對HMW-GS電泳分離的影響Fig.5 Effect of separation voltage on the electrophoresisseparation of HMW-GS

2.3.2 分離溫度的選擇

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH 2.5；毛細管內徑25 μm，檢測波長214 nm，分離電壓20 kV，10.0 kV進樣5 s。當分離溫度為25 ℃時，圖形清晰，亞基峰形對稱，四個主峰出峰時間依次為10.93、12.81、15.98和18.13 min(圖6)。溫度為30 ℃時，亞基分離度與25 ℃時接近，但亞基出峰更早；四大主峰分別出現在9.31、11.69、13.18和14.77 min，時間跨度為52.4 min，整體遷移速度更快；亞基縱向擴散與峰展寬比例擴大，從而帶來主峰辨識度的提高。溫度為35 ℃時亞基分離度達到最大，出峰時間分別為8.22、10.38、13.14和15.56 min，但是亞基峰高明顯變小，基線波動較大，噪音增強，導致圖譜分辨率明顯下降。由此可見，分離溫度為30 ℃時分離效果最好。

2.3.3 PDA檢測波長的選擇

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH 2.5；毛細管內徑25 μm，分離電壓20 kV，運行溫度30 ℃，10.0 kV進樣5 s。結果(圖7)表明，PDA檢測波長與分離圖譜中亞基峰寬和基線噪音密切相關，對峰高有輕微影響，對圖譜亞基出峰時間的影響不大。PDA波長由214 nm轉變為200 nm時，基線噪音更小，亞基峰寬減小，峰高略微增大，這使得亞基縱向擴散與峰展寬比例進一步增大，帶來了主峰辨識度的提高。因此PDA檢測波長為200 nm時最佳。

A、B、C曲線分別對應25、30和35 ℃。

A,B and C curves are 25,30 and 35 ℃,respectively.

圖6毛細管內運行溫度對HMW-GS電泳分離的影響

Fig.6Effectofthecapillarytemperatureonthe

electrophoresisseparationofHMW-GS

A:214 nm; B:200 nm.圖7 PDA檢測波長對HMW-GS電泳分離圖譜的影響Fig.7 Effect of PDA wavelengths on theelectrophoresis separation of HMW-GS

2.3.4 進樣時間的選擇

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH 2.5；毛細管內徑25 μm，檢測波長200 nm，分離電壓20 kV，運行溫度30℃，10.0 kV進樣。當進樣時間為5 s時，峰形清晰，亞基分離度高，基線平穩。進樣時間為8 s時，電泳遷移速率與進樣5 s差異不大，但峰寬明顯增大，1Bx7、1Dx2主峰峰高顯著降低，四個主峰之間界線模糊，亞基分離度較差，圖譜分辨率降低(圖8)。因此，進樣時間為5 s時分離效果好。

A:8 s; B:5 s.圖8 不同進樣時間對HMW-GS電泳分離圖譜的影響Fig.8 Effect of different sampling time on theelectrophoresis separation of HMW-GS

2.3.5 毛細管內徑的選擇

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH 2.5；檢測波長200 nm，分離電壓20 kV，運行溫度30 ℃，10.0 kV進樣5 s。結果(圖9)表明，毛細管內徑同時影響亞基峰寬、分離度及基線穩定性。毛細管內徑為25 μm時，亞基分離度高，亞基峰形對稱，基線水平，背景噪音低。當毛細管內徑為50 μm時，亞基分離度降低，峰寬增大，峰高降低；電泳遷移率降低，亞基出峰較晚，1Dy12、1By8、1Bx7、1Dx2四個主峰依次出現在第10.81、12.24、13.78和15.58 min處；1Dy12主峰出峰之前有明顯的基線波動，電泳分離后期基線逐漸上升，且有倒峰及雜峰出現。由此可見，毛細管內徑為25 μm時最佳。

2.4 HMW-GS毛細管電泳高效分離體系及驗證

在優化后條件下，即緩沖液組分為15% ACN+75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC，pH為2.5；毛細管內徑25 μm， PDA檢測波長200 nm，分離電壓20 kV，運行溫度30 ℃，樣品10.0 kV電進樣5 s，對中國春的HMW-GS連續多次電泳分離。結果(圖10)發現，第1～2 min為系統峰(溶劑峰)，3～6 min為微量LMW-GS區域，HMW-GS在9 min后開始出峰，1Dy12、1By8、1Bx7、1Dx2亞基16 min內全部分離完成。連續30次、連續6 d重復試驗(圖10、11)，均顯示圖譜亞基峰形一致、分離度高、基線水平。通過混合進樣方式，與常規的Phos-gly/ACN體系進行對比。

A:25 μm; B:50 μm.圖9 不同毛細管內徑對HMW-GS電泳分離圖譜的影響Fig.9 Effect of different inner diameters of the capillaryon the electrophoresis separation of HMW-GS

圖中所示曲線從下往上依次為第1、5、10、15、20、25、30次電泳分離曲線。

The curves from bottom to top are first,fifth,tenth,fifteenth,twentieth,twenty-fifth and thirtieth electrophoresis separation curves,respectively.

圖10中國春HMW-GS連續30次毛細管電泳分離圖譜

Fig.10Imageofthirtyconsecutiveinjections

ofHMW-GSofChineseSpring

圖中所示曲線從下往上依次為第1、2、3、4、5、6天電泳分離曲線。

The curves from bottom to top are the curves of the first day,the second day,the third day,the fourth day,the fifth day and the sixth day,respectively.

圖11中國春HMW-GS連續6d電泳圖譜

Fig.11ContinuousrepeatedexperimentofHMW-GSofChineseSpringforsixdays

結果(圖12、表1)表明，該體系在亞基分離速度、圖譜分辨率上更具有優勢，對于遷移率比較接近的亞基(如1Dy12與1Dy10、1By9與1By8、1Dx5與1Dx2)更容易表征；亞基出峰時間RSD(<0.2%)值遠小于后者，說明分離重現性更高。

A、B均為中國春(Null，7+8，2+12)與石4185(1，7+9，2+12)、陜182(1，7+8，5+10)混合樣的分離圖譜。圖A電泳條件：25 μm毛細管，200 nm檢測波長，緩沖液組分75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH 2.5，分離電壓20 kV，運行溫度30 ℃，10.0 kV電進樣5 s。圖B電泳條件為：25 μm毛細管，214 nm檢測波長，緩沖液組分100 mmol·L-1Phosphate-glycine+0.05% HPMC+20% ACN，pH 2.5，分離電壓12.5 kV，運行溫度40 ℃，10.0 kV電進樣5 s。

A and B are both the separation curves obtained from the mixture of Chinese Spring(Null,7+8,2+12) ,Shi 4185(1,7+9,2+12) and Shaan 182(1,7+8,5+10).The electrophoresis conditions of Fig.A:Inner diameter of the capillary was 25 μm; Detection wavelength was 200 nm; Buffer composition was 75 mmol·L-1IDA + 0.05% HPMC + 15% ACN,with pH at 2.5; Separation voltage was 20 kV; Operating temperature was 30 ℃; Samples were injected for five seconds by electric method under under 10.0 kV.The electrophoresis conditions of Fig.B:Inner diameter of the capillary was 25 μm;Detection wavelength was 214 nm; Buffer composition was 100 mmol·L-1phosphate-glycine + 0.05% HPMC + 20% ACN,with pH at 2.5;Separation voltage was 12.5 kV;Operating temperature was 40 ℃;Samples were injected for five seconds by electric method under under 10.0 kV.

圖12 不同分離體系效果比較

表中數據為連續30次電泳分離所得平均值。

The data is the average value obtained from 30 consecutive injections.

3 討 論

小麥HMW-GS與小麥品質密切相關，其分離鑒定是品質研究的重要環節。與傳統方法相比，HPCE具有快速、自動化、分辨率高等特點。依據電泳圖譜可獲得亞基的準確峰高、遷移時間等，有助于亞基定性及定量分析。本試驗結果表明，HPCE分離體系中緩沖液pH、緩沖液組分、分離電壓、運行溫度、進樣時間、檢測波長及毛細管內徑等條件的變化均會影響分離效果。

Bean等[20]最先將IDA/ACN緩沖系統應用到蛋白HPCE分析中，主要對醇溶蛋白的分離進行了探討，本試驗首次將其引入到HMW-GS的HPCE分析中，通過優化條件，同樣獲得了良好的分離效果。Righetti等[21]表明IDA/ACN緩沖液系統分離蛋白質的最佳pH為2.2～2.8。本研究發現，pH > 2.5會導致基線不穩定趨勢增加。由于HMW-GS屬于大分子蛋白[22]，容易吸附在毛細管壁上，使電滲流改變，影響電泳分離重復性，極端pH可以抑制蛋白吸附，維持電滲流穩定，但當pH達到一定范圍時，該作用將顯著減弱。推測pH>2.5時抑制作用降低，電泳后期HMW-GS吸附作用增強，從而產生了較多的焦耳熱，導致了基線的上升。IDA在毛細管電泳中主要影響分離的重現性，本研究結果表明，其濃度為75 mmol·L-1時，分離體系重現性較好。HPMC是一種親水高分子聚合物[23]，在緩沖液系統中具有充當篩分介質[24]和動態修飾的作用[25]，影響亞基分離度及基線狀況。HPMC濃度增大可能提高毛細管電泳靈敏度，但相應的圖譜噪音也會增強。適當降低濃度可增大亞基分離度。由于緩沖液中HPMC濃度的改變亦可影響其粘性，緩沖介質粘性是影響電滲流的主要因素之一[26]，因此控制HPMC濃度有助于穩定毛細管電泳電滲流。ACN在緩沖液系統中的作用是通過加快樣品堆積，促進遷移速率[27]，其濃度的變化往往影響電泳靈敏度，本試驗發現，當ACN濃度提高時圖譜噪音也會相應增高，再次驗證了這一觀點。由于HPCE是以高壓電場為驅動力，溫度影響著管內溶液的粘性[28]，因此兩者數值升高均會提高圖譜遷移速率，但也為電泳系統帶來不穩定因素。本試驗中，PDA檢測波長對分離效果的影響主要是在圖譜分辨率上，由于不同物質的最大吸收波長不同[29]，改變PDA檢測波長則會引起圖譜信噪比的變化。電壓進樣時間往往會影響進樣塞的長度，進樣塞長度過大時容易使峰展寬大于縱向擴散[30]，與本試驗結果一致。本試驗還發現，增大毛細管內徑，會使分離度降低、基線波動，這可能是因為毛細管作為分離通道，其內徑對散熱影響較大；減小其內徑有利于電泳過程中熱量的散出，減少焦耳熱的產生；內徑過大，容易在毛細管內部形成溫度梯度(中心溫度高)，破壞塞流，進而導致亞基縱向擴散小于區帶展寬[31]，降低分離效率。

本研究通過分析HPCE中不同因素對HMW-GS分離效果的影響，結合連續重復實驗及比對驗證，成功構建了基于IDA緩沖液系統的HPCE高效分離體系，由于該體系下圖譜亞基分離度高、重現性好，因此有利于HMW-GS的定性分析。結合SDS-PAGE及分子標記等，可對HPCE分離圖譜中不同類型HMW-GS進行表征，確定標準遷移時間。依據標準遷移時間，即可完成小麥材料中相關HMW-GS的快速鑒別。同時，該指標亦可作為新型未知亞基的鑒定標準。

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