基于微流控技術(shù)的體外多參數(shù)快速診斷POCT系統(tǒng)的設(shè)計(jì)*

王天星,鐘隆潔,蘇凱麒,秦 臻,胡 寧,王 平

(浙江大學(xué)生物傳感器國(guó)家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室,生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生儀學(xué)院,杭州 310027)

伴隨世界性的城市工業(yè)化和現(xiàn)代化,全球慢性患病率正呈快速上升趨勢(shì),慢性病患者數(shù)量日益增多,對(duì)全球范圍人群的健康產(chǎn)生巨大影響。單以慢性病中最常見的糖尿病為例,根據(jù)2015年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)年鑒報(bào)告(參考文獻(xiàn):2015 IDF DIABETES ATLAS),全球糖尿病人群已高達(dá)4.15億,預(yù)計(jì)到2040年,全球糖尿病人群將達(dá)到6.42億[1]。糖尿病的主要危害是長(zhǎng)期高血糖引起的慢性并發(fā)癥,包括動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病變、糖尿病腎病、足病、眼病等,導(dǎo)致糖尿病患者致死致殘[2]。糖尿病人群患有超重或肥胖、高血壓、血脂異常、高尿酸血癥等心血管危險(xiǎn)因素的顯著比例高于普通人群。實(shí)際上糖尿病患者發(fā)生心血管病變有多重危險(xiǎn)因素,依次為低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低、糖化血紅蛋白(HbA1c)升高、高血壓和吸煙等。研究結(jié)果顯示[3]:不患有血脂異常及高血壓的單純糖尿病患者之比例不足三分之一,三分之二以上的糖尿病患者都至少患有高血壓及血脂異常中的一種。如可聯(lián)合血糖、血脂、尿酸、血酮等快速檢測(cè)指標(biāo),對(duì)于患者早期發(fā)現(xiàn)代謝異常、及時(shí)干預(yù)并監(jiān)測(cè)代謝指標(biāo)非常重要。而多種指標(biāo)快速聯(lián)合檢測(cè)的技術(shù)為臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入基層社區(qū)醫(yī)院、甚至實(shí)現(xiàn)家庭化的現(xiàn)場(chǎng)和床旁檢驗(yàn)創(chuàng)造了條件,同時(shí)為通過互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行大數(shù)據(jù)醫(yī)療診斷提供了技術(shù)手段,使得包括檢查檢驗(yàn)在內(nèi)的醫(yī)療資源高度融合與信息共享,也為慢病實(shí)現(xiàn)三級(jí)診療、促進(jìn)不同級(jí)別和類別醫(yī)療機(jī)構(gòu)間的有序轉(zhuǎn)診打下基礎(chǔ)。

圖1 毛細(xì)作用驅(qū)動(dòng)的微流控通道技術(shù)原理

便攜型體外診斷產(chǎn)品的發(fā)展經(jīng)歷了第1代定性檢測(cè)(試條試紙)[4-5];第2代半定量(色板卡比色或半定量?jī)x器閱讀)[6-7];第3代全定量系統(tǒng)(較少的手工操作)[8];第4代產(chǎn)品往自動(dòng)化、智能化、網(wǎng)絡(luò)化、多參數(shù)、高精度、快速、微量樣本等方向發(fā)展。第一、二代的便攜型體外診斷產(chǎn)品常用于非專業(yè)的家庭、個(gè)人健康保健,而第3代、第4代產(chǎn)品,將用于醫(yī)院門急診、社區(qū)醫(yī)療的定量檢測(cè)。早期的便攜型體外診斷產(chǎn)品發(fā)展始于20世紀(jì)中期,主要是以干化學(xué)試紙檢測(cè)血糖及尿糖。此后免疫層析和斑點(diǎn)金免疫滲濾等免疫測(cè)定技術(shù)推動(dòng)了感染性疾病、心臟標(biāo)志物等便攜型體外診斷產(chǎn)品技術(shù)發(fā)展。基于微流控技術(shù)的生物傳感器的出現(xiàn)對(duì)便攜型體外診斷產(chǎn)品是一個(gè)重大轉(zhuǎn)折,后續(xù)體外診斷產(chǎn)品小型化、多參數(shù)、高精度發(fā)展將進(jìn)入快車道,可解決人們對(duì)質(zhì)量問題的困憂,且可實(shí)現(xiàn)測(cè)試耗用樣本微量化以及多參數(shù)同步檢測(cè)等臨床需求。

由于生物反應(yīng)的特點(diǎn),多種因素會(huì)影響產(chǎn)品的精度,包括生物敏感試劑的選擇,電極敏感材料的選擇、原物料性能的波動(dòng)、生產(chǎn)過程的控制、生產(chǎn)環(huán)境的變化、樣本內(nèi)外源物質(zhì)的干擾、操作影響因素等,例如:血樣的紅細(xì)胞壓積(Hematocrit)影響著血液的粘度和流量及其運(yùn)輸氧氣的能力、血樣的擴(kuò)散速度、物質(zhì)在細(xì)胞間的擴(kuò)散速度等等,以及一些內(nèi)外源物質(zhì)的干擾,顯著影響測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確度[9];另外,不同的電極材料和不同的生物敏感試劑的匹配度直接影響產(chǎn)品的靈敏度、線性、穩(wěn)定性,這也是直接制約開發(fā)多參數(shù)POCT的技術(shù)障礙之一[10];還有,原物料的選擇和控制、生產(chǎn)工藝的搭建和控制,是保證生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)品精度良好的關(guān)鍵。因此,當(dāng)前國(guó)產(chǎn)體外診斷即時(shí)檢測(cè)產(chǎn)品測(cè)試精度偏低、測(cè)試項(xiàng)目單一、性能不穩(wěn)定是制約國(guó)內(nèi)體外診斷即時(shí)檢測(cè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。本論文基于毛細(xì)驅(qū)動(dòng)的微流控和微納傳感技術(shù),結(jié)合電分析化學(xué)、光化學(xué)、生物傳感器技術(shù),開發(fā)了一種高精度、多參數(shù)的POCT集成系統(tǒng),從而能夠用于慢性病生化指標(biāo)的多參數(shù)聯(lián)合檢測(cè)。

1 原理和方法

1.1 毛細(xì)作用驅(qū)動(dòng)的微流控通道技術(shù)原理和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米)處理或操縱微小流體(體積為納升到皮升)的系統(tǒng)所涉及的科學(xué)和技術(shù),是一門涉及化學(xué)、流體物理、微電子、新材料、生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程的新興交叉學(xué)科。因?yàn)榫哂形⑿突⒓苫忍卣?微流控裝置通常被稱為微流控芯片,也被稱為芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on a Chip)和微全分析系統(tǒng)(Micro-Total Analytical System)。為了進(jìn)一步提高測(cè)量精密度和一致性,我們采取電化學(xué)原理的生物傳感器設(shè)計(jì)基于毛細(xì)作用驅(qū)動(dòng)的微流控通道加工技術(shù),通過對(duì)親水材料電極的選擇、通道的精密微加工、以及運(yùn)用微流控模型理論推算的孔道設(shè)計(jì),保證產(chǎn)品進(jìn)樣、生產(chǎn)加工和測(cè)試的穩(wěn)定性,保證產(chǎn)品的準(zhǔn)確可靠。其毛細(xì)作用驅(qū)動(dòng)的微流控通道技術(shù)原理如圖1所示。

在電化學(xué)和光化學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上,融合微流控技術(shù),采用復(fù)雜的算法校正,如空白值校正和相同測(cè)試環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)曲線校正,可以有效降低內(nèi)外源物質(zhì),血液中紅細(xì)胞,溫濕度等系列干擾,從而使產(chǎn)品測(cè)試精度獲得極大的提升。以血糖檢測(cè)為例,血樣的紅細(xì)胞壓積(Hct)影響著血液的粘度和流量及其運(yùn)輸氧氣的能力、血樣的擴(kuò)散速度、物質(zhì)在細(xì)胞間的擴(kuò)散速度等等,以及一些干擾物質(zhì)的干擾,顯著影響測(cè)試結(jié)果。本文利用微流控技術(shù),在芯片上集成了微通道,試樣預(yù)處理、反應(yīng)及檢測(cè)等裝置,同時(shí)結(jié)合多電極技術(shù),成功消除了一些常見干擾物的干擾和紅細(xì)胞壓積的影響,解決POCT產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中的問題,最少僅需0.5 μL樣本量即可完成測(cè)試。

圖2 集成有試樣預(yù)處理裝置和探測(cè)單元的測(cè)試芯片結(jié)構(gòu)示意圖

測(cè)試時(shí),樣本自試樣引入微通道引入測(cè)試芯片后,首先通過上游紅細(xì)胞壓積探測(cè)單元,把試樣的Hct數(shù)據(jù)傳遞到儀器中,然后流經(jīng)試樣預(yù)處理單元,消除干擾物質(zhì)的干擾后繼續(xù)流入下游試樣反應(yīng)區(qū),經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)及電極反應(yīng)后轉(zhuǎn)化為電信號(hào),該信號(hào)被檢測(cè)電極檢測(cè),儀器對(duì)得到的多個(gè)信號(hào)進(jìn)行一系列的計(jì)算校正后最終得出準(zhǔn)確的測(cè)試值,整個(gè)過程僅需2 min～3 min,達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

1.2 生物敏感試劑反應(yīng)原理和多聚物3D骨架酶固定化和分子交互結(jié)晶成型技術(shù)

本論文采用電化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)疾病指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。各指標(biāo)的檢測(cè)反應(yīng)原理如圖3所示。

利用一些多聚物特有的3D骨架結(jié)構(gòu)(如圖4(a)和圖4(b)的多聚物纖維結(jié)構(gòu)),把反應(yīng)酶固定到其骨架結(jié)構(gòu)上,其較大的表面積可以提高酶的反應(yīng)效率、儲(chǔ)存穩(wěn)定性;3D骨架結(jié)構(gòu)能允許反應(yīng)分子的自由擴(kuò)散,但其微孔結(jié)構(gòu)又能有效把紅細(xì)胞等可能干擾反應(yīng)的大顆粒排除在外,減少干擾提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。分子交互結(jié)晶成型是指兩種不同的晶體彼此之間以一定的結(jié)晶學(xué)取向關(guān)系交互連生,或一種晶體嵌生于另一種晶體中的現(xiàn)象。利用分子間的相互作用,圖5(b)是利用分子交互結(jié)晶成型技術(shù)的結(jié)晶形態(tài)比圖5(a)中常規(guī)試劑的結(jié)晶更加均勻,使產(chǎn)品一致性更好,測(cè)試精度更高。

圖3 各種試劑反應(yīng)原理

圖4 多聚物3D骨架結(jié)構(gòu)

圖5 結(jié)晶形態(tài)

2.3 多參數(shù)體外快速診斷系統(tǒng)POCT設(shè)計(jì)

通常血糖檢測(cè)范圍為0.6 mmol/L～33.3 mmol/L,總膽固醇的檢測(cè)范圍2.6 mmol/L～11.7 mmol/L,尿酸的檢測(cè)范圍為181 μmol/L～1181 μmol/L,血酮(β-羥丁酸)的檢測(cè)范圍為0～8.0 mmol/L,4個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)濃度范圍差別非常大,反應(yīng)的靈敏度要求差異大,對(duì)檢測(cè)儀器不同量程的檢測(cè)精度要求高;另一方面,如總膽固醇,需要多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),反應(yīng)弱而且慢,靈敏度低,如血酮,其酶促反應(yīng)和電化學(xué)反應(yīng)很難匹配,反應(yīng)信號(hào)差,靈敏度低,而尿酸,因其濃度低,對(duì)靈敏度要求高。

因?yàn)槿艹鲭娏魑⑷?通常在nA～μA級(jí)別),在進(jìn)行檢測(cè)電路總體設(shè)計(jì)時(shí),需要保證高增益、低噪聲和低失真特性;此外,由電極/溶液構(gòu)成的電化學(xué)體系等效電路相對(duì)比較復(fù)雜,在保證檢測(cè)電路具有高增益、低失真的同時(shí),還應(yīng)保證足夠的相位裕度,避免電路不穩(wěn)定甚至自激現(xiàn)象的發(fā)生。圖6是硬件系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)圖。如圖,硬件系統(tǒng)主要分為電化學(xué)檢測(cè)電路、電源模塊和無線模塊三部分。

圖6 儀器的硬件系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)圖

在三電極檢測(cè)過程中,參比電極與工作電極信號(hào)微弱,需要避免引入外部噪聲。傳統(tǒng)電路中多采用無源屏蔽方法,即引入同軸電纜或其他類似結(jié)構(gòu),以中心導(dǎo)線作為參比電極、工作電極信號(hào)走線,屏蔽層接地避免外部干擾。但是,因?yàn)樾盘?hào)線與屏蔽線之間不可避免存在較大的分布電容,電容充放電的過程會(huì)影響信號(hào)波形,增大檢測(cè)誤差。因此,為避免無源屏蔽引發(fā)的問題,設(shè)計(jì)中對(duì)參比電極和工作電極引入了有源屏蔽。有源屏蔽電路包含兩個(gè)環(huán)節(jié),即對(duì)參比電極的有源屏蔽,及對(duì)工作電極的有源屏蔽。為保證低噪聲特性,屏蔽不僅包括由電路SMA同軸接口引出的電極連線,還包括 PCB 內(nèi)部的關(guān)鍵走線,且PCB內(nèi)部走線以短路環(huán)的形式提供保護(hù)。

為進(jìn)一步降低噪聲,電化學(xué)檢測(cè)電路使用四層FR4材質(zhì)基底PCB設(shè)計(jì),并以PCB第1層為關(guān)鍵走線布線層,第2層為地層,為微弱信號(hào)提供完整的地平面;并以第3層為電源層,第4層為輔助布線層,通過地層與電源層,將微弱信號(hào)與可能產(chǎn)生干擾的強(qiáng)信號(hào)進(jìn)行隔離。電池組采用聚合物鋰離子電芯組合,聚合物電芯具有內(nèi)阻小,容量大,循環(huán)次數(shù)多,壽命長(zhǎng),無記憶效應(yīng)防爆等優(yōu)點(diǎn);電池組帶智能控制保護(hù)電路,能防止過充,過放,過流,短路。

下位機(jī)軟件程序集成在單片機(jī) MSP430 Flash存儲(chǔ)器中,主要完成的功能為:接收上位機(jī)發(fā)送的命令與參數(shù)指令,完成相應(yīng)的操作,并將數(shù)據(jù)發(fā)送給上位機(jī)。其算法實(shí)現(xiàn)流程圖如圖7所示。

圖7 多參數(shù)體外快速診斷系統(tǒng)的電化學(xué)算法實(shí)現(xiàn)流程圖

DPSV 算法主要涉及以下參數(shù):富集電壓與富集時(shí)間、靜息電壓與靜息時(shí)間、掃描初始電壓、掃描終止電壓、掃描步進(jìn)電壓、采樣周期、采樣寬度、脈沖周期與脈沖幅度等。DPSV 算法中,在一個(gè)脈沖周期內(nèi),檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行兩次電流采樣,即分別在前采樣點(diǎn)采集得到電流數(shù)據(jù)I1,在后采樣點(diǎn)得到電流數(shù)據(jù)I2,并求得兩者電流之差;通過上述過程,能有效地消除充放電電流對(duì)于檢測(cè)的影響。DPSV算法以10 ms為單位時(shí)間,并將程序的一次執(zhí)行過程嵌入10 ms延時(shí)時(shí)序,能夠有效減少程序的運(yùn)行時(shí)間,并保證算法生成波形的周期誤差控制在±0.2%以內(nèi),滿足檢測(cè)需要。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

在電化學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上,融合微流控技術(shù),采用復(fù)雜的算法校正,可以有效降低內(nèi)外源物質(zhì),血液中紅細(xì)胞,溫濕度等系列干擾,從而使產(chǎn)品測(cè)試精度獲得極大的提升。以血糖檢測(cè)為例,血樣的紅細(xì)胞壓積(Hct)影響著血液的粘度和流量及其運(yùn)輸氧氣的能力、血樣的擴(kuò)散速度、物質(zhì)在細(xì)胞間的擴(kuò)散速度等等,以及一些干擾物質(zhì)的干擾,顯著影響測(cè)試結(jié)果。本文利用微流控技術(shù),在芯片上集成了微通道,試樣預(yù)處理、反應(yīng)及檢測(cè)等裝置,同時(shí)結(jié)合多電極技術(shù),成功消除了一些常見干擾物的干擾和紅細(xì)胞壓積的影響,使得產(chǎn)品的測(cè)試精準(zhǔn)度極大地提升。同時(shí)由于采用微流控技術(shù),試劑設(shè)計(jì)精巧,在集成上述諸多功能的基礎(chǔ)上,最少僅需0.5 μL樣本量即可完成測(cè)試。

圖8 各因素對(duì)血糖測(cè)試結(jié)果的影響對(duì)比

抗壞血酸在人體中廣泛存在,達(dá)到一定濃度會(huì)對(duì)血糖測(cè)試產(chǎn)生極大的干擾,本文采用了在測(cè)試芯片上集成了試樣預(yù)處理裝置,干擾從40%降低到了5%的可接受范圍,如圖8(a)所示。

進(jìn)一步在測(cè)試芯片上集成了紅細(xì)胞壓積探測(cè)單元,顯著降低了紅細(xì)胞壓積的影響,使得本測(cè)試芯片的應(yīng)用人群范圍可以覆蓋到貧血及新生兒等特殊人群,其測(cè)試結(jié)果如圖8(b)所示。

本文利用利用分子平衡抑制作用、高分子多聚物網(wǎng)架與酶的固定化技術(shù)、分子組合結(jié)晶成型的技術(shù),開發(fā)傳感器生物敏感試劑,成功解決了試劑的熱穩(wěn)定性、反應(yīng)適配性、試劑溶液均一性、試劑固定生產(chǎn)一致性和可控性、干燥后固定試劑均一性等問題,保證傳感器的一致性,同時(shí)使反應(yīng)靈敏度和重復(fù)精度大幅提高,如圖9所示。圖9(a)中曲線表示改進(jìn)前FAD型葡萄糖脫氫酶試劑的線性測(cè)試反應(yīng)曲線圖:反應(yīng)信號(hào)很弱,不同濃度樣本的反應(yīng)曲線梯度不能很好的分開。圖9(b)中曲線表示改進(jìn)后FAD型葡萄糖脫氫酶試劑的線性測(cè)試反應(yīng)曲線圖:反應(yīng)信號(hào)強(qiáng),不同濃度樣本的反應(yīng)曲線梯度很好的分開,同一濃度反應(yīng)曲線的一致性好。

圖9 FAD型葡萄糖脫氫酶試劑改進(jìn)前和改進(jìn)后的反應(yīng)曲線對(duì)比

血酮體(β-羥丁酸)試劑的開發(fā):采用復(fù)合β-羥丁酸脫氫酶及新型電子介體技術(shù),使反應(yīng)靈敏度和重復(fù)精度大幅提高,測(cè)試時(shí)間大幅縮短,如圖10所示。圖10(a)中曲線表示改進(jìn)前β-羥丁酸試劑的線性測(cè)試反應(yīng)曲線圖:反應(yīng)信號(hào)較弱,不同濃度樣本的反應(yīng)曲線梯度分開不顯著,同一濃度反應(yīng)曲線的一致性不佳。圖10(b)中曲線表示改進(jìn)后β-羥丁酸試劑的線性測(cè)試反應(yīng)曲線圖:反應(yīng)信號(hào)強(qiáng),不同濃度樣本的反應(yīng)曲線梯度很好的分開,同濃度反應(yīng)曲線的一致性好。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,我們?cè)O(shè)計(jì)的基于微納傳感結(jié)合微流控的高精度、多參數(shù)體外快速診斷POCT系統(tǒng),在檢測(cè)血糖、血酮、等方面具有良好的一致性和實(shí)用性,同時(shí)具有良好的抗干擾性能。

圖10 血酮體(β-羥丁酸)試劑改進(jìn)前和改進(jìn)后的反應(yīng)曲線對(duì)比

4 結(jié)論

本文主要介紹了基于微流控及微納傳感技術(shù)的高精度、多參數(shù)體外快速診斷系統(tǒng)。利用高分子多聚物3D骨架酶固定化技術(shù)以及分子交互結(jié)晶成型的技術(shù),成功解決了試劑溶液均一性、試劑固定生產(chǎn)一致性和可控性、干燥后固定試劑均一性等問題,保證產(chǎn)品優(yōu)良的一致性;通過微納材料技術(shù)的應(yīng)用,成功提高了試劑的靈敏度和檢測(cè)限。應(yīng)用基于血液特異的電阻抗譜分析以及基于擴(kuò)散差異的動(dòng)態(tài)電流技術(shù)對(duì)血樣內(nèi)源外源干擾物和存儲(chǔ)操作環(huán)境等因素對(duì)測(cè)量結(jié)果的抗干擾處理。基于毛細(xì)作用驅(qū)動(dòng)的微流控通道加工技術(shù),通過對(duì)親水材料電極的選擇、通道的精密微加工、以及運(yùn)用微流控模型理論推算的孔道設(shè)計(jì),保證檢測(cè)的準(zhǔn)確可靠。在生物傳感芯片上集成了微通道、試樣預(yù)處理、反應(yīng)及檢測(cè)等裝置,同時(shí)結(jié)合多電極參比技術(shù)、電阻抗譜分析技術(shù)、動(dòng)態(tài)電流檢測(cè)技術(shù),采用多維度多參數(shù)聯(lián)合的算法校正,成功降低消除了測(cè)試樣品的內(nèi)外源物質(zhì)、紅細(xì)胞壓積、溫濕度等系列干擾,有效克服了常規(guī)POCT產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中的精度和靈敏度不夠的問題。最后通過檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,驗(yàn)證了基于微流控及微納傳感技術(shù)的高精度、多參數(shù)體外快速診斷系統(tǒng)可以可靠和快速地對(duì)血酮、血糖等指標(biāo)進(jìn)行綜合檢測(cè)的功能。

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