益氣活血方介導P38MAPK信號通路促進突出椎間盤組織重吸收的機制研究

高春鵬朱 宇姜 宏劉建文

（1.泰興市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇泰興225400； 2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇蘇州215009；3.華東理工大學生物工程與藥學院國家重點實驗室，上海200237）

腰椎間盤突出癥（Lumbar intervertebral disc herniation，LIDH）是臨床常見病、多發(fā)病。近年來，腰椎間盤突出后發(fā)生影像學重吸收的報道日益增多[1-2]。LIDH患者在無化學融核和外科干預(yù)的情況下，突出髓核自發(fā)消失或者變小的現(xiàn)象稱為“重吸收”（resorption）[3]。前期基礎(chǔ)研究及臨床觀察隨訪發(fā)現(xiàn)，姜宏經(jīng)驗方“益氣活血方”能明顯改善LIDH患者的臨床癥狀并促進重吸收的發(fā)生[4]。新的研究發(fā)現(xiàn)，P38絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogenactivated protein kinases，P38MAPK）信號通路能夠通過調(diào)控細胞因子表達及細胞凋亡參與椎間盤的退變[5]。因此我們推測，益氣活血方刺激突出髓核組織的新生血管化和細胞外基質(zhì)的代謝失衡，促進突出髓核組織的重吸收與38MAPK信號通路的過度激活有關(guān)。本實驗旨在觀察并對比益氣活血方和P38MAPK特異性阻斷劑對大鼠突出髓核的組織結(jié)構(gòu)和組織中基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）、MMP-9、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及P38MAPK基因和蛋白表達的影響，探討益氣活血方促進破裂型椎間盤突出重吸收的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物與分組 選擇3月齡體重在180～220g的SD雄性大鼠30只，由上海Slac實驗動物有限責任公司提供，合格證號：SCXX（滬）2015-0005。

1.2 藥物、主要儀器和試劑 中藥益氣活血方（蘇州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供），藥物組成：生炙黃芪（各）20g、當歸10g、川芎15g、炒白術(shù)10g、防己10g、木瓜10g、威靈仙10g、地龍15g、水蛭6g、白芥子6g，加冷水500mL浸泡30min，煎煮（火力2100W）開鍋后 煎30min取 汁200mL，再 加 水300mL煎30min取汁200mL，2次相兌并濃縮成1.5g/mL煎劑保存于恒溫冰箱中。MMP-3抗體、MMP-9抗體、VEGF抗體、P38MAPK抗體，proteintech公司；磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶（P-P38MAPK）抗體，Santa Cruz公司；DMSO，蘇州昆山金城試劑廠；P38MAPK特異性阻斷劑，SB203580（S1076），Selleck Chemicals公司；總RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EasyTaq PCR試劑盒，Gibico公司；熒光定量PCR試劑盒，華北制藥股份有限公司；TL-18M臺式高速冷凍離心機，上海離心機械研究所；SW-CJ-1FD超凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SBE6003電泳儀，上海申能博彩生物有限公司；PCR基因擴增儀，Bio-Rad公司；iCycler熒光定量PCR儀，Eppendorf公司；XSP-17C倒置生物顯微鏡，上海長方光學儀器有限公司；Ti-S熒光顯微鏡，日本尼康公司；高效液相色譜儀，島津國際貿(mào)易有限公司。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 大鼠采用完全隨機分組分為對照組、中藥組和中藥+P38阻斷劑組，每組10只。3組采用同一術(shù)式造模，5只1籠，室溫22℃，通風良好，12h光照循環(huán)（6：00—18：00）。

獲取尾椎（Co）椎間盤：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，腹腔注射鹽酸氯胺酮（0.10g/kg）麻醉，背部L5附近備皮，常規(guī)消毒，在無菌條件下切取大鼠第3、4尾椎椎間盤（包含上下軟骨終板）。使用7號注射器針頭（內(nèi)徑0.5mm、外徑0.7mm）刺破所取椎間盤的纖維環(huán)，使髓核組織暴露，用萬分之一單位電子天平稱重并記錄，隨后將尾椎椎間盤放置于無菌聚碳酸酯（PC）管套并浸泡在生理鹽水中備用。前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)3月齡SD雄性大鼠第3、4尾椎椎間盤的直徑為（3.56±0.42）mm，高為（3.18±0.40）mm。

植入椎間盤：以第5腰椎為中心，沿背部皮膚后正中線切約2.5cm縱形切口，分離筋膜及肌肉組織（背最長肌、多裂肌），暴露L4、L5的棘突和椎板，用骨鉗咬除L4、L5棘突及全部椎板和部分椎弓根，并用7號針頭穿破黃韌帶并劃破硬脊膜（使尾椎椎間盤接觸腦脊液，模擬椎管內(nèi)環(huán)境），劈開骨缺口附近豎脊肌，用血管鉗擴大肌肉裂隙成一空腔。將已固定在PC管套中的Co3、4椎間盤植入空腔內(nèi)，逐層縫合，切口涂抹紅霉素眼膏以預(yù)防感染。待大鼠蘇醒，可正常活動后放入籠中正常飼養(yǎng)。

2.2 藥物干預(yù) 造模后第2日，開始藥物干預(yù)。對照組予生理鹽水灌胃并腹腔注射2%DMSO（10mg/kg），1次/d；中藥組予益氣活血方煎劑按9.1mL/kg劑量1次/d灌胃，同時腹腔注射2%DMSO（10mg/kg，1次/d）；中藥+P38阻斷劑組予腹腔內(nèi)注射P38MAPK的阻斷劑SB203580（使用前用2%DMSO稀釋，10mg/kg，1次/d），同時等體積生理鹽水灌胃。各組均連續(xù)藥物干預(yù)4周。灌胃給藥劑量根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”臨床等效劑量=臨床用量×等效劑量系數(shù)（0.018）計算得出。

2.3 取材 于藥物干預(yù)4周后將各組大鼠麻醉處死，沿原手術(shù)切口打開背部肌肉，取出包埋的椎間盤去除PC管套后迅速用電子天平稱重并記錄。將椎間盤分為2份分別標號：一份放入10%的中性甲醛固定液細胞固定24h，制備4μm厚的組織切片標本，行HE染色；另一份用0.01mmol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗去血漬后放入已標記的無菌EP管中，于-80℃冰箱中保存。預(yù)留用于Real Time PCR、Western Blot等檢測。

根據(jù)教學目標以及學生已有的知識經(jīng)驗，找到本節(jié)課的知識生長點，準確定位要解決的核心問題。例如“正比例的意義”這節(jié)課，教學目標如下表：

2.4 HE染色觀察組織退變情況 切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水化，蘇木素染色10min，沖洗，并用氨水返藍，孵育后水洗置于0.5%伊紅染色1min，70%乙醇浸泡分化5min后，水洗并鏡檢。常規(guī)脫水，透明，封片。

2.5 Real Time PCR方法檢測目的基因的mRNA表達 提取總RNA：按Gibico公司RNA抽提試劑盒說明書，應(yīng)用Trizol試劑溶液提取各組NPCs的總RNA。反轉(zhuǎn)錄：在超凈臺中，取DEPC處理的200μL PCR管置冰上，依次加入1μg總RNA，1.0μL cDNA模板，加入Forward Primer（20μmol/L）和Reverse Primer（20μmol/L）各0.25μL，0.125μL Taq酶，2μL dNTP，1.5μL MgCl2（25mmol/L），2.5μL 10×Buffer緩沖液，加入17.375μL的ddH2O，使反應(yīng)體系總體積達到25.0μL，于42℃反轉(zhuǎn)錄1h，獲取cDNA。通過Real-time PCR對TNF-α、IL-1β、P38MAPK、MMP-3、MMP-9進行擴增，引物序列以基因管家GAPDH為內(nèi)參，利用Primer premier 5.0為待測基因設(shè)計引物序列，見表1。

表1 引物序列

PCR反應(yīng)：95℃條件下，5min預(yù)變性，30s變性，56～65℃30s退火（所有的引物的退火溫度58℃），72℃條件下延伸重復35個循環(huán)，每次循環(huán)讀取CT（cycle threshold）值，72℃ 5min最終延伸。每0.2℃讀取CT值，繪制裂解曲線。

瓊脂糖凝膠電泳：點樣法取內(nèi)參擴增產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物與6×DNA Loading Buffer混勻，微量移液器上樣。120V電壓進行電泳約30min。當溴酚藍在凝膠中遷移適當距離后，停止電泳，拿出凝膠，在紫外透射下觀察目的條帶，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

所有的原始數(shù)據(jù)均借助實時定量PCR儀所附帶的軟件來完成，標記跟蹤待測基因，最后與標準曲線進行對比，通過CT值表示相關(guān)基因的表達水平。我們對每一個基因的樣品都相對獨立地重復3次（n=3），取CT平均值代表基因在該條件下的mRNA水平。每份待測基因的CT值與內(nèi)參GAPDH的比值作為各組mRNA的相對表達量。

2.6 Western Blot方法檢測蛋白表達 根據(jù)說明書提取椎間盤組織的總蛋白并按BCA蛋白定量法對細胞核濃度進行定量，配制10%SDS-聚丙烯酰胺分離膠，在電泳儀上對等量蛋白進行電泳，分離蛋白質(zhì)，根據(jù)待測蛋白大小分別進行轉(zhuǎn)膜。用TBST緩沖液漂洗后置于封閉液中封閉2h，室溫下加入配制好的1mL一抗溶液，4℃孵育過夜。回收一抗后，加入二抗37℃孵育2h。

TBST漂洗后，將PVDF膜放入免疫印跡化學發(fā)光試劑中進行顯影，通過計算機圖像處理技術(shù)（Quantity One）測定各蛋白條帶的灰度值，以待測基因的灰度面積與內(nèi)參照β-actin的灰度面積的比值為半定量資料，重復3次，并進行統(tǒng)計分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組椎間盤質(zhì)量改變比較 對照組椎間盤質(zhì)量減小值為（8.17±5.19）mg，中藥組為（19.29±5.34）mg，中藥+P38阻斷劑組為（11.91±6.88）mg，中藥組椎間盤質(zhì)量減小值明顯高于其他2組（P＜0.05），提示益氣活血方能促進突出椎間盤的縮小和重吸收。

3.2 HE染色觀察各組椎間盤組織形態(tài) 中藥組椎間盤較其他2組形態(tài)退變更為明顯，光鏡下見纖維環(huán)膠原纖維排列紊亂，細胞核染色數(shù)量減少，細胞基質(zhì)膠凍樣改變，并伴有大量炎性細胞和新生血管浸潤，見圖1。椎間盤形態(tài)退變程度與質(zhì)量減小趨勢一致。

3.3 各組椎間盤VEGF、P38MAPK、MMP-9、MMP-3的mRNA表達比較 結(jié)果見表2。

3.4 各組髓核組織P-P38MAPK、P38MAPK、VEGF、MMP-9、MMP-3的蛋白表達比較 結(jié)果見表3。

圖1 尾椎髓核組織HE染色（×20）

表2 各組椎間盤VEGF、MMP-3、MMP-9、P38MAPK的基因相對表達量比較（±s）

表2 各組椎間盤VEGF、MMP-3、MMP-9、P38MAPK的基因相對表達量比較（±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05；#與中藥+P38阻斷劑組比較，P＜0.05。

對照組　10　1.00±0.03　1.00±0.30　1.00±0.10　1.00±0.02中藥組　10　3.56±0.04*#　5.67±1.30*#　4.15±0.23*#　7.86±0.27*#中藥＋P38阻斷劑組　10　1.14±0.08　1.97±0.31　3.51±0.24　3.28±0.47

表3 各組椎間盤VEGF、MMP-3、MMP-9、P-P38MAPK、P38MAPK的蛋白表達比較（±s）

表3 各組椎間盤VEGF、MMP-3、MMP-9、P-P38MAPK、P38MAPK的蛋白表達比較（±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05；#與中藥+P38阻斷劑組比較，P＜0.05。

對照組　1 0　0.865±0.047　0.721±0.023　0.777±0.028　1.079±0.017　0.812±0.040中藥組　1 0　1.463±0.100*#　1.657±0.032*#　0.905±0.038*#　1.746±0.032*#　1.079±0.065*#中藥+P38阻斷劑組　1 0　0.711±0.041*　0.657±0.021　0.670±0.025*　1.275±0.020*　0.785±0.040

4 討論

LIDH可歸屬于中醫(yī)學“腰腿痛”“痹證”范疇，證屬氣滯血瘀。這與現(xiàn)代醫(yī)學對LIDH是由突出物壓迫導致神經(jīng)根瘀血、水腫，伴發(fā)各種炎癥介質(zhì)刺激引發(fā)微循環(huán)障礙的病理認識具有相通之處。課題組姜宏教授結(jié)合中醫(yī)傳統(tǒng)理論和現(xiàn)代醫(yī)學研究認為，本病的辨證重點應(yīng)抓住“虛”“瘀”二字，故擬“益氣活血”為本病的治療大法，研制了治療LIDH的專方“益氣活血方”，此方能顯著改善LIDH患者的臨床癥狀并能促進突出組織的重吸收。方中重用黃芪為君藥，大補脾肺之元氣，使氣旺則血行，血行則濕散，現(xiàn)代藥理學研究顯示黃芪可提高自身免疫效應(yīng)[6]；當歸配伍川芎，既能養(yǎng)血和血，又能活血化瘀，其有效成分川芎嗪能改善血液流變學，促進新生血管的形成，并能夠降低血小板的黏附，緩解突出物壓迫引起的神經(jīng)根瘀血、缺血、水腫[7]。君臣配伍起到益氣活血的功效。白術(shù)、防己二藥合用有利水消腫之效，威靈仙可宣通十二經(jīng)絡(luò)，又有“化骨除鯁”之能，木瓜、白芥子祛濕通絡(luò)，5味佐藥能夠減輕神經(jīng)根和脊髓的水腫。地龍、水蛭通絡(luò)散結(jié)，祛瘀生新。諸藥配合，達到益氣、活血、祛痰、通絡(luò)的功效。

近年來大量研究表明，突出組織的新生血管化、細胞外基質(zhì)代謝失衡以及椎間盤細胞的凋亡是導致椎間盤突出重吸收的主要原因。VEGF作為一種血管生長刺激因子，其高表達可作為突出組織新生血管化的標志。研究表明新生血管化可誘導以血管反應(yīng)為中心的免疫性炎癥，并刺激多種蛋白水解酶的釋放，加速椎間盤組織退變（IDD）[8]。ECM的代謝失衡和突出髓核組織的細胞凋亡是IDD主要原因[9]。MMPs是ECM代謝的關(guān)鍵酶類，其高表達一方面能直接降解絕大部分ECM成分（除外蛋白多糖）；另一方面可以通過弱化細胞-基質(zhì)的黏附加速椎間盤細胞的凋亡[10]。研究顯示，MMPs家族中MMP-3、MMP-9是加速ECM降解及軟骨破壞的關(guān)鍵因素，其高表達能夠?qū)е伦甸g盤組織的IDD，從而促進重吸收過程[11]。

Studer[12]在外培養(yǎng)的髓核細胞加入P38MAPK抑制劑后能逆轉(zhuǎn)由TNF-α誘導的MMPs/TIMPs比值升高的趨勢，表明P38MAPK信號通路能夠調(diào)控MMPs的表達從而在椎間盤ECM降解過程中起著至關(guān)重要的作用。因此，本研究提出益氣活血方通過介導38MAPK信號通路加速突出髓核組織的新生血管化和細胞外基質(zhì)的代謝失衡，促進突出髓核組織的重吸收的假設(shè)。

本實驗結(jié)果表明益氣活血方能夠激活P38MAPK的磷酸化，促進突出髓核組織中VEGF、MMP-3、MMP-9的基因和蛋白表達，促進突出椎間盤組織的新生血管化和ECM的降解，加速突出組織的重吸收過程；而中藥+P38阻斷劑組無論是椎間盤組織形態(tài)還是VEGF、MMP-3、MMP-9的基因和蛋白表達均受到明顯抑制。由此可見，益氣活血方上調(diào)VEGF、MMP-3、MMP-9的基因和蛋白表達，促進突出組織重吸收的作用主要通過介導P38MAPK信號通路的磷酸化實現(xiàn)。

然而，P38MAPK的磷酸化能夠提高VEGF的表達，促進突出椎間盤組織的新生血管化，這勢必加重患者突出部位的炎性疼痛，但臨床上大多服藥患者并無腰痛加重的癥狀。考慮可能為中藥復方中不同組分在體內(nèi)除調(diào)控P38MAPK信號通路外，還與其他幾條經(jīng)典信號通路之間存在調(diào)節(jié)關(guān)系，具體原因有待進一步剖析該方的作用機制以及P38MAPK與其他幾條經(jīng)典信號通路之間的聯(lián)系。