安徽漢族冠心病患者CYP2C19基因多態性研究

李　潔，程筱雯，汪　波，徐元宏

冠心病是由冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、低氧或壞死而導致的心臟病，嚴重危害著人類健康。氯吡格雷及阿司匹林聯合進行雙重抗血小板治療已經被廣泛應用于行經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)，能明顯降低術后不良心血管事件發生率及支架內血栓形成的風險[1]。但在臨床應用及實踐中顯示，氯吡格雷對冠心病人群的抗血小板作用存在個體差異，部分患者對氯吡格雷的抗血小板作用出現低反應甚至毫無應答，此種現象被稱為氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)[2-3]。目前證實CYP2C19的基因多態性是CR最重要的內部影響因素[4]。CYP2C19是細胞色素P450氧化酶(cytochrome P450 oxidases，CYP450)第二亞家族的重要成員，作為一種重要的藥物代謝酶，參與多種藥物的體內代謝，其中包括氯吡格雷、奧美拉唑、苯妥英及丙戊酸等[5]。CYP2C19酶由于遺傳多態性，不同個體間酶活性存在顯著不同。通過該酶代謝的氯吡格雷等藥物隨著患者基因型的不同，其療效和副作用也明顯不同[6-7]。通過檢測患者代謝速度類型，合理調整用藥劑量，是提高經CYP2C19酶代謝的藥物的療效，減少毒副作用的有效途徑。該研究擬采用DNA微陣列芯片法對244例安徽地區漢族冠心病患者的CYP2C19基因多態性分布特點進行分析，同時與不同地區漢族人群，各少數民族之間的CYP2C19基因多態性進行比較，以期為冠心病人群個體化用藥提供參考。

1　材料與方法

1.1病例資料世界衛生組織將冠心病分為5大類：無癥狀心肌缺血(隱匿性冠心病)、心絞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭(缺血性心臟病)和猝死5種臨床類型。臨床中常常分為穩定性冠心病和急性冠狀動脈綜合征。基于以上范圍選取2017年安徽醫科大學第一附屬醫院住院的244例安徽地區患者。所有患者為漢族，男146例，女98例；年齡41～84(64.3 ±10.4)歲。

1.2主要儀器和試劑全血基因組DNA提取試劑盒、CYP2C19基因檢測試劑盒、雜交顯色試劑盒、BR-526-24全自動雜交儀及BE-2.0生物芯片識別儀(上海百傲科技股份有限公司)；PCR擴增儀(賽默飛世爾科技有限公司，型號ABI7300)；臺式高速離心機(德國Eppendorf公司，型號Centrifuge 5425 R)；恒溫加熱儀(德國Eppendorf公司，型號ThermoMixer C)。

1.3檢測方法

1.3.1全血基因組DNA提取靜脈取血2 ml，加至EDTA抗凝管中，顛倒混勻后吸取200 μl，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取和純化基因組DNA。提取的DNA濃度通過紫外分光光度計進行測定，濃度應達到10～16 ng/μl，A260/A280比值在1.5～2.0之間。DNA樣本-20 ℃保存，凍融不超過3次。

1.3.2PCR擴增每份樣本需要擴增兩個位點(636G/A，681G/A)，試劑盒根據擴增位點提供特異性引物1及引物2，分別配制2個獨立的反應體系。PCR總反應體系為25 μl：基因組DNA模板5 μl，CYP2C19擴增液(包含基因特異性引物，氯化鉀，dNTP等)19 μl；反應液A(Taq聚合酶，UNG酶)1 μl。PCR反應條件：50 ℃ 5 min，94 ℃預變性5 min，35個循環(94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s， 72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min。PCR產物2～8 ℃保存。

1.3.3全自動雜交及基因型檢測吸取2個CYP2C19反應體系的PCR擴增產物各10 μl加入180 μl雜交緩沖液中，依次加入預雜交液、雜交反應液、洗脫液、抗體及顯色液，按照雜交顯色試劑盒說明書操作，運行全自動雜交儀，采用單堿基延伸結合微陣列芯片法對位點進行檢測。雜交結束后取出玻璃芯片，放入BE-2.0生物芯片識別儀進行掃描，利用ArrayDoctor軟件及CYP2C19基因型分析程序(上海百傲公司)分析樣品的 CYP2C19 基因型。依據等位基因功能缺失的不同，分為快代謝基因型*1/*1(681GG/636GG)；中間代謝型*1/*2(636GG/681GA)、*1/*3(636GA/681GG)；慢代謝基因型*2/*2(636GG/681AA)、*2/*3(636GA/681GA)和*3/*3(636AA/681GG)。

1.4統計學處理應用SPSS 17.0軟件進行統計分析。按Hardy-Weinberg平衡定律檢驗樣本的群體代表性。用頻數計數法計算各基因型及等位基因頻率，各組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1安徽地區漢族冠心病患者等位基因頻率及CYP2C19代謝型分布采用DNA微陣列基因芯片法，共檢測244例安徽漢族冠心病患者的CYP2C19基因型，各種基因型生物芯片識別圖見圖1。CYP2C19*1、 CYP2C19*2和CYP2C19*3 3種等位基因的頻率分別為60.66%、31.76%和7.58%(表1)。其中*1/*1基因型(636GG，681GG)92例(37.70%)，*1/*2基因型(636GG，681GA)91例(37.30%)，*1/*3基因型(636GA，681GG)21例(8.61%)，*2/*2基因型(636GG，681AA)25例(10.25%)，*3/*3基因型(636AA，681GG)1例(0.41%)，*2/*3基因型(636GA，681GA)14例(5.74%)。根據基因型判斷，快代謝型92例(37.70%)，中間代謝型112例(45.91%)，慢代謝型40例(16.39 %)，見表2。CYP2C19等位基因分布符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律(χ2=0.519，P=0.991)，說明安徽漢族冠心病患者人群CYP2C19的檢測結果具有群體代表性。男性和女性的CYP2C19基因型頻率差異無統計學意義(χ2=2.852，P=0.764)；不同性別之間各代謝型頻率差異亦無統計學意義(χ2=1.535，P=0.464)，見表2。

圖1　DNA微陣列芯片法檢測CYP2C19基因多態性

等位基因男女總計CYP2C19*1179(60.47)117(39.53)296(60.66)CYP2C19*292(59.35)63(40.66)155(31.76)CYP2C19*321(56.76)16(43.24)37(7.58)

2.2不同人群CYP2C19基因多態性分布比較本研究將不同地區漢族人群CYP2C19基因多態性分布進行比較(表3)，結果顯示，安徽地區漢族冠心病人群與西安、汕頭及沈陽漢族人群的CYP2C19基因型分布差異存在統計學意義(P<0.05)。CYP2C19基因型分布差異主要體現在快代謝型及中間代謝型，各漢族人群慢代謝型分布差異無統計學意義(P>0.05)。安徽漢族冠心病人群快代謝型頻率低于西安、汕頭及沈陽，而中間代謝型正好相反。另外，安徽漢族冠心病人群CYP2C19基因型分布與正常安徽漢族人群相比，差異無統計學意義(P>0.05)。不同民族之間CYP2C19代謝型分布差異具有統計學意義，安徽漢族人群與傣族、白族、回族、維吾爾族、哈薩克斯坦、蒙古族及黎族之間代謝型分布差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。安徽漢族人群快代謝型比例高于回族及蒙古族，低于傣族、白族、維吾爾族哈薩克斯坦及黎族；中間代謝型人群中，安徽漢族人群高于白族及哈薩克斯坦，低于傣族、回族、維吾爾族、蒙古族及黎族；而在慢代謝型人群中，安徽漢族人群高于傣族、白族、維吾爾族、哈薩克斯坦及黎族，低于回族及蒙古族。

表2　安徽地區冠心病患者男、女人群CYP2C19基因多態性分布[n(%)]

表3　不同地區漢族人群CYP2C19代謝型分布比較[n(%)]

不同地區漢族資料來自參考文獻[8]；NA：未提供

表4　中國各民族CYP2C19基因多態性分布比較

不同民族資料來自參考文獻[8]；NA：未提供

3　討論

本研究采用DNA微陣列芯片法對244例安徽漢族冠心病人群的CYP2C19基因多態性進行分析，結果顯示CYP2C19*1、 CYP2C19*2和CYP2C19*3 3種等位基因的頻率分別為60.66%、31.76%和7.58%，代謝型以快代謝型和中間代謝型為主，這與研究[8]結果一致。然而仍然有16.39%的冠心病患者為慢代謝型，其對氯吡格雷的抗血小板作用會出現低反應甚至毫無應答，需要調整用藥劑量。因此，檢測冠心病患者的CYP2C19基因多態性對于氯吡格雷個體化合理用藥意義重大。另外，研究顯示冠心病人群與正常人群的基因型分布差異無統計學意義。前者平均年齡均明顯高于后者。且不同性別人群的CYP2C19基因型及代謝型分布差異也不具有統計學意義。說明年齡及性別對CYP2C19基因多態性分布的影響不大。研究顯示，安徽地區漢族冠心病人群CYP2C19基因多態性分布與大部分地區漢族人群一致，僅與西安、汕頭及沈陽漢族人群的CYP2C19基因型分布差異存在統計學意義。不同民族之間CYP2C19基因型多態性分布存在明顯的差異，其中哈薩克斯坦快代謝型頻率最高，蒙古族中間代謝型頻率最高，回族慢代謝型頻率最高，主要是由于各民族地理位置不同。

參考文獻