白藜蘆醇在體外通過(guò)自噬作用抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的研究

孫傳名，方文秀，周榮生，汪陶榮，趙衛(wèi)東，陳曉宇

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[1]。植物抗毒素白藜蘆醇(resveratrol，Res)是從花生、虎杖、葡萄等植物中提取的多元酚類，生物學(xué)和藥理學(xué)活性廣泛，研究[2-3]顯示其具有抗炎、抗氧化、預(yù)防腫瘤和抗老化等特性。真核生物體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)衰老、變性、受損的細(xì)胞器需依賴細(xì)胞內(nèi)自噬-溶酶體途徑降解，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞器質(zhì)量，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，防止致突變物質(zhì)聚集于細(xì)胞或發(fā)生基因突變[4]。Res抗宮頸癌HeLa細(xì)胞作用已有文獻(xiàn)[5]報(bào)道，但關(guān)于自噬在Res對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖抑制中的作用研究報(bào)道較少。該研究在體外采用不同濃度Res處理人宮頸癌HeLa 細(xì)胞，檢測(cè)Res對(duì)HeLa 細(xì)胞的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用，同時(shí)，檢測(cè)Res誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞自噬情況，探討Res對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器白藜蘆醇(純度≥99%，美國(guó)Aladdin Sigma公司，用時(shí)稀釋于培養(yǎng)液)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Genview公司)；培養(yǎng)基RPMI-1640、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；二甲亞砜(DMSO)、Hoechst 33258染液、青霉素和鏈霉素溶液、蛋白預(yù)染Marker、一抗稀釋液、ECL化學(xué)發(fā)光液(上海碧云天生物有限公司)；BCA蛋白試劑定量盒(美國(guó)Pierce公司)；一抗：兔抗人微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3(light chain 3 of the microtubule associated protein 1，LC3A/B)、p62、Beclin-1、GAPDH多克隆抗體(美國(guó)Cell signaling 公司)；二抗：辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔多克隆抗體(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜(美國(guó)Millipore公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Lecia公司)；半干轉(zhuǎn)膜儀(大連競(jìng)邁生物科技有限公司)。

1.2宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)HeLa 細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中(內(nèi)置1%青霉素和鏈霉素雙抗)，置于37 ℃、5% CO2孵箱中單層傳代培養(yǎng)。按照5×103/孔將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa 細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。HeLa細(xì)胞分為對(duì)照組、白藜蘆醇組。對(duì)照組只加RPMI-1640培養(yǎng)液，白藜蘆醇組(加入Res 5、10、20、50、100 μmol/L處理)，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再用DMSO 振蕩溶解，于波長(zhǎng)490 nm下酶標(biāo)儀讀取吸光度(absorbance，A)值即A490值。按下列公式計(jì)算增殖抑制率：增殖抑制率(%)= (對(duì)照組A490-白藜蘆醇組A490)/對(duì)照組A490×100 %。

1.3Hoechst33258染色檢測(cè)Res處理HeLa細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，按照5×103/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，予不同濃度Res(0、5、30、100 μmol/L)處理48 h，吸盡培養(yǎng)液，4%多聚甲醛溶液固定15 min， PBS清洗固定后的HeLa細(xì)胞2次，每次10 min，棄去清洗液并吸干，30 μl染色液Hoechst 33258避光染色10 min，PBS清洗，2次，每次10 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4免疫細(xì)胞化學(xué)觀察Res處理HeLa細(xì)胞后LC3A/B抗體表達(dá)按照1.0×105/孔將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa 細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，加入Res，使其終濃度為20、100 μmol /L，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸盡培養(yǎng)液，4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS漂洗HeLa細(xì)胞3次，每次10 min。加入0.1% TritonX-100 透膜10 min，PBS 漂洗HeLa細(xì)胞3次，每次10 min。山羊血清封閉1 h，勿洗，加入1 ∶150稀釋的兔抗人LC3A/B多克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。次日PBS 漂洗3次，每次10 min后，加入1 ∶100 稀釋的FITC 標(biāo)記羊抗兔IgG，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次，每次10 min；加入DAPI 染核5 min，應(yīng)用抗熒光淬滅劑封固，Lecia激光共聚焦顯微鏡攝片。

1.5Westernblot法檢測(cè)Res處理HeLa細(xì)胞后p62、Beclin-1蛋白表達(dá)25 ml培養(yǎng)瓶中按照1.0×106/孔將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa 細(xì)胞接種，每瓶加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液5 ml，培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度Res(0、10、30、100 μmol /L)處理48 h，RIPA裂解液提取總蛋白，Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，取30 μg總蛋白SDS-PAGE電泳(分離膠10%， 濃縮膠5%)分離，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，在4 ℃孵育p62、Beclin-1 蛋白一抗過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光，曝光壓片，顯影、定影。Alpha 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)照相記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1不同濃度白藜蘆醇對(duì)HeLa細(xì)胞增殖情況的影響將對(duì)照組(只RPMI-1640 培養(yǎng)液)的細(xì)胞增殖的抑制率設(shè)為0，與對(duì)照組比較，白藜蘆醇組(加入Res 5、10、20、50、100 μmol/L)處理后，HeLa細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增高，分別為(9.2%±1.5%)、(13.4%±1.7%)、(20.1%±2.1%)、(32.6%±2.3%)、(40.4%±2.8%)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.17，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度白藜蘆醇對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖情況的影響

2.2Res處理HeLa細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡情況倒置顯微鏡下，與對(duì)照組(0 μmol/L Res)相比，HeLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度Res溶液(5、30、100 μmol/L)刺激48 h 后，HeLa細(xì)胞則呈不規(guī)則梭形、巢狀聚團(tuán)生長(zhǎng)。熒光顯微鏡下，Hoechst 33258 染色后于觀察可見(jiàn)，細(xì)胞核變形或皺縮，核染色質(zhì)進(jìn)一步聚集、斷裂，呈月牙狀或明亮顆粒狀藍(lán)色熒光，可見(jiàn)明顯凋亡小體。且隨著Res濃度的升高，核凋亡現(xiàn)象更加明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度Res處理HeLa細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡情況 Hoechst 33258染色×100

2.3Res處理HeLa細(xì)胞后LC3A/B表達(dá)的影響在激光共聚焦顯微鏡下觀察可見(jiàn)，LC3A/B 綠色熒光較為均勻的分布于對(duì)照組HeLa 細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中，熒光強(qiáng)度相對(duì)較弱；不同濃度的Res處理HeLa細(xì)胞后，HeLa 細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中LC3A/B 綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且較不均勻，以Res高濃度(100 μmol /L)明顯，見(jiàn)圖3。

2.4Westernblot法檢測(cè)Res處理HeLa細(xì)胞后p62和Beclin-1蛋白表達(dá)情況Western blot 檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，使用白藜蘆醇不同濃度(10、30、100 μmol /L)處理HeLa 細(xì)胞48 h 后，隨著白藜蘆醇濃度增高，p62 蛋白表達(dá)逐漸降低，而Beclin-1 表達(dá)逐漸增強(qiáng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，與對(duì)照組p62 蛋白表達(dá)(0.46±0.09)比較，不同濃度白藜蘆醇(10、30、100 μmol /L)處理HeLa 細(xì)胞的p62 蛋白表達(dá)(0.35±0.08)、(0.29±0.06)、(0.22±0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.71，P<0.01)；與對(duì)照組Beclin-1蛋白表達(dá)(0.18±0.05)比較，不同濃度白藜蘆醇(10、30、100 μmol /L)處理HeLa 細(xì)胞的Beclin-1 蛋白表達(dá)(0.29±0.07)、(0.41±0.08)、(0.53±0.11)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.07，P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖3 不同濃度Res處理HeLa細(xì)胞后LC3A/B 表達(dá)激光共聚焦 ×400

A：對(duì)照組；B：Res 5 μmol/L；C：Res 30 μmol/L；D：Res 100 μmol/L

圖4 Res處理HeLa細(xì)胞后p62 和Beclin-1 蛋白表達(dá)影響

1：對(duì)照組；2：Res 5 μmol/L；3：Res 30 μmol/L；4：Res 100 μmol/L；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

婦科惡性腫瘤宮頸癌發(fā)病率高、惡性程度大，我國(guó)每年約有2萬(wàn)余名婦女死于宮頸癌[1]。為改善宮頸癌患者預(yù)后，降低放療、化療副反應(yīng)和復(fù)發(fā)率，科研人員作出不斷研究。天然的多酚類化合物Res具有廣泛的生物學(xué)和藥理學(xué)活性，在植物虎杖、葡萄、花生等廣泛分布芪類化合物，研究[2,6]顯示其具有抗氧化、抗炎作用，可顯著抑制肺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝癌、腎癌等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究通過(guò)人宮頸癌HeLa細(xì)胞為對(duì)象，觀察Res對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。MTT檢測(cè)結(jié)果表明，不同劑量Res對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖有抑制作用，該抑制作用呈劑量依賴性。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因調(diào)控下，為適應(yīng)外界環(huán)境的影響主動(dòng)程序死亡的過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，形態(tài)學(xué)上，凋亡細(xì)胞變形且體積縮小，貼壁培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)變圓、皺縮、脫落，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊聚，分割成塊狀和凋亡小體等。Hoechst 33258是常用的DNA特異性染料，與DNA非嵌入式的結(jié)合DNA的A-T堿基區(qū)，通過(guò)熒光顯微鏡，紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光[7]。本研究在Hoechst 33258 染色熒光顯微鏡下觀察到，Res處理組宮頸癌HeLa 細(xì)胞的胞核變形或皺縮，核染色質(zhì)聚集呈月牙狀或明亮顆粒狀藍(lán)色熒光，且隨著Res濃度的升高，核凋亡現(xiàn)象更加明顯。表明不同劑量Res可促進(jìn)宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡形成。

惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中會(huì)表現(xiàn)出自噬功能失調(diào)，且與其損傷DNA、降低染色體穩(wěn)定性有關(guān)[8]。自噬是機(jī)體細(xì)胞為適應(yīng)低氧、饑餓、營(yíng)養(yǎng)奪獲和環(huán)境應(yīng)激(如藥物應(yīng)用)的自我保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致腫瘤抵抗治療作用，故調(diào)節(jié)自噬可以有效預(yù)防和治療腫瘤，提高腫瘤治療過(guò)程中的化療耐藥，為腫瘤治療提供新的思路[9]。在激光共聚焦顯微鏡下，觀察到Res處理組HeLa 細(xì)胞后細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)大量LC3A/B 綠色熒光分布，且熒光強(qiáng)度較對(duì)照組增強(qiáng)。LC3A/B是自噬標(biāo)記蛋白，檢測(cè)細(xì)胞LC3A/B 熒光強(qiáng)度可作為自噬活性的標(biāo)志。本研究顯示在對(duì)照組宮頸癌HeLa 細(xì)胞中LC3A/B 熒光強(qiáng)度較弱，明顯低于不同濃度Res治療組，表明LC3A/B 表達(dá)下調(diào)，甚至缺失存在于宮頸癌HeLa 細(xì)胞中；Res升高宮頸癌HeLa 細(xì)胞LC3表達(dá)，增強(qiáng)了HeLa 細(xì)胞的自噬活性或潛能。

研究[10]表明，自噬對(duì)腫瘤生長(zhǎng)起到抑瘤作用，Beclin-1是另一種重要的自噬標(biāo)記蛋白，Beclin-1基因敲除的小鼠患惡性腫瘤比野生型小鼠容易，缺失Beclin-1基因時(shí)，細(xì)胞內(nèi)積累更多的異常細(xì)胞器和蛋白質(zhì)；而自噬標(biāo)記蛋白p62 失活會(huì)引起自噬功能障礙，DNA損傷，易引起腫瘤發(fā)生，p62 表達(dá)上升是自噬損傷的標(biāo)志，饑餓、營(yíng)養(yǎng)奪獲和環(huán)境應(yīng)激等可上調(diào)p62 基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)從頭合成p62 蛋白[11]。本研究Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Res可濃度依賴性的升高HeLa 細(xì)胞Beclin-1 表達(dá)；且Res可濃度依賴性降低HeLa細(xì)胞p62蛋白表達(dá)。表明Beclin-1、p62蛋白表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞自噬活性有一定的影響，Res可以通過(guò)調(diào)節(jié)Beclin-1、p62 的表達(dá)量而影響HeLa 細(xì)胞自噬。