利用DNA條形碼技術的兩種實蠅鑒定研究

王溪橋 尤 佳 王軍平 文朝慧 滿 岳

（甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心，甘肅 蘭州 730010）

實蠅，昆蟲綱、雙翅目Diptera、實蠅科Tephritidae昆蟲的通稱，英文名稱fuit fly。全世界已知實蠅約500個屬，4500多種，中國約存在400多種。實蠅體形中小，圓球形頭部，中胸部發達，雙翅具斑。實蠅是植食性昆蟲，為害植物的根、莖、葉、花乃至果實。其中，35%的種類（約1500種）可能為害各種果，對農業有重要經濟意義的實蠅種類超過100種，還有150多種是次要的或潛在的害蟲。這些為害水果和蔬菜實蠅大部分屬于寡鬃實蠅屬Dacus、果實蠅屬Bactrocera、小條實蠅屬Ceratitis、繞實蠅屬Rhagoletis和按實蠅屬Anastrepha等。其中，具明顯重要性的種類，如地中海實蠅、桔小實蠅、昆士蘭實蠅、棗實蠅都是著名的有害實蠅種，這些種類在世界各國均屬檢疫對象。中國已發現若干種類為害柑橘、芒果、青棗、楊桃、棗、番石榴、梨、瓜等果蔬的重要害蟲，例如桔小實蠅、柑橘大實蠅、蜜柑大實蠅、南瓜實蠅、棗實蠅、番石柳實蠅、瓜實蠅、棗實蠅、枸杞實蠅等[1]。具條實蠅Bactrocera scutellata和南瓜實蠅Bactrocera tau均隸屬于雙翅目Diptera實蠅科Tephritidae果實蠅屬Bactrocera，該屬昆蟲主要分布于亞洲熱帶、亞熱帶和暖溫帶以及澳大利亞和南太平洋地區，少數種類分布于非洲南部和夏威夷群島[2]。對實蠅類害蟲進行積極防控和嚴格檢疫，防止其侵入我國，對保障國內農業生產安全具有重大意義。

傳統形態鑒定只能針對成蟲，對成蟲蟲體的完整性要求較高，需要有較豐富的分類經驗和技能的鑒定人員完成。此外，近似種之間的外部形態特征區別微小，部分形態非常相似，這也給傳統形態分類增加了難度。近年來，隨著分子生物學技術技術的快速發展，各種分子水平的檢測手段被廣泛應用于實蠅的種類鑒定，如AFLP、RFLP以及DNA測序等[3]。DNA條形碼（DNA barcode）是指生物體內能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段。受零售業中被作為產品通用代碼的商品條形碼的啟發，加拿大Guelph 大學的分類學家Paul Hebert在2003年首次提出DNA 條形碼概念, 即利用線粒體細胞色素C氧化酶亞單位I（COI）的特定基因序列區域來做DNA 條形編碼的基礎，用于物種鑒定[4]。通過分析COI基因及其來源基因組核苷酸含量之間的關系，結果表明800余個COI基因5 端的DNA條形碼序列準確地代表了其來源完整線粒體的基因信息，證明對于未測序的基因組，從DNA 條形碼序列可以快速檢測并預測其完整基因組的組成。目前，隨著DNA條形碼技術的迅速發展，全球分類學家認識到分子手段檢測鑒定物種的重要性，對Genbank數據庫中COI基因序列的條目的貢獻不斷增加，使DNA條形碼鑒定技術的優勢愈發凸顯，與傳統鑒定方法相比，操作簡便，準確度高，檢測樣本范圍擴大，即使樣本部分受損，僅用少量生物樣本即可檢測鑒定，也不會影響識別結果[5-14]。

我國對果實蠅屬的條形碼研究也取得了一定進展，梁亮等（2011）對中國果實蠅屬25種的155條COⅠ基因序列進行了遺傳距離分析和構建發育樹，最終得出，COI基因條碼序列能對除桔小實蠅復合體外的部分中國果實蠅屬種類能進行準確鑒定[15]。劉慎思等（2012）針對桔小實蠅桔小實蠅 B.dorsalis 的卵、幼蟲、蛹以及成蟲的殘缺肢體樣本，利用DNA條形碼技術，建立了利用DNA條形碼技術的實蠅類害蟲快速鑒定技術體系，結果表明DNA條形碼技術完全可以用于口岸截獲的實蠅幼體及殘體的準確鑒定[16]。李靜等（2014）利用COI基因片段，對入境旅客非法攜帶的實蠅幼蟲進行了序列測定，并對培養出的成蟲進行了形態鑒定，最終確定了實蠅種類，為檢疫部門的DNA條碼技術在實蠅鑒定中的應用提供了重要依據[17]。

1 材料和方法

1.1 供試樣品

供試具條實蠅Bactrocera scutellata (Hendel)、南瓜實蠅Bactrocera tau標本由甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心外繁種子實驗室采集，標本浸入100%無水乙醇中-20℃條件下保存。

1.2 方法

1.2.1 形態鑒定

依據吳佳教等[1]資料，測量并綜合分析各實蠅形態特征，采用LEICA M205A體式顯微鏡及LEICA DMC4500顯微成像系統拍攝整體和局部形態特征進行鑒定。

1.2.2 DNA提取

實蠅標本的DNA提取使用TaKaRa公司MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒。剪取實蠅標本25mg肢體，參照試劑盒說明書進行DNA提取。以ddH2O為空白對照，使用試劑盒進行提取操作。使用Eppendorf BioSpectrometer微量核酸蛋白檢測儀對提取得到DNA進行檢測。

1.2.3 樣本DNA的PCR擴增及測序

1.2.3.1 PCR擴增

參考Folmer所使用的PCR擴增引物[18]，使用通用引物進行DNA擴增，引物序列LCO1490，5'-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3';HCO21985'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。由寶生物（TAKARA）公司委托合成。PCR反應使用TAKARA公司Premix Taq（R004A）試劑盒，反應擴增體系為 25.0μl， 包 含 premix taq12.5μl、20μmol/L 上、 下 游引 物 各 1.0μl、 模 板 DNA2.0μl、ddH2O8.5μl。PCR 儀使 用Eppendorf Mastercycler nexus,反 應 程 序：94℃預 變 性 3min；94℃ 45s，50℃ 45s，72℃ 45s，35個循環；72℃延伸10min。COI基因PCR擴增粗產物大小應為為685bp。PCR產物4℃保存，1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，DNAmarker使用TAKARA公司DL1000DNAmarker。

1.2.3.2 PCR產物測序及基因序列比對分析

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測確證后，送蘇州金唯智公司進行PCR產物純化及測序。將得到的DNA序 列 在 NCBI（ 網 址 https∶//blast.ncbi.nlm.nih.gov） 及BOLDsystem（網址 http∶//www.boldsystems.org）在線數據庫進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 形態鑒定結果

2.1.1 具條實蠅 B.（Zeugodacus）scutellata

形態特征：成蟲黑色與黃色相間。頭部中顏板具一對黑色大顏面斑，呈卵圓形。上側額鬃1對，下側額鬃3對；具內頂鬃、外頂鬃和頰鬃；單眼鬃細小或缺如。中胸背板黑色，縫后側黃色條終于翅內鬃著生處或其之后處，縫后中黃色條梭形或線形；肩胛和背側板胛黃色，橫縫兩側具黃色斑伸向中部；前翅上鬃、小盾前鬃和翅內鬃存在，背中鬃缺如。小盾片較扁平，黃色，具黑色端斑，此斑大并伸越到兩小盾端鬃之外，小盾鬃1對。后小盾片和中背片全為黑色。翅前緣帶黑色，翅端擴展成斑；dm-cu橫脈覆蓋褐色斑，該斑伸達翅后緣，前端可能不連續；臀條寬；bm室長是寬的2倍；cup室后端角延伸段長，其長度超過A1+CuA2脈段長。足淡黃色，各足腿節不具暗色斑，后足脛節基部1/3黑褐色。第2～4節腹背板黑色，基橫帶寬，但第4和第5腹背板的基橫帶中部有時分離；第3～5節腹背板具黑褐色中縱帶，該縱帶有時在各節的端部處中斷；第5腹背板具橢圓形腺斑。（圖1、2）

圖1 具條實蠅背面

圖2 具條實蠅側面

2.1.2 南瓜實蠅 B.（Zeugodacus）tau

形態特征：成蟲黑色與黃色相間。頭部顏面黃色；顏面斑黑色，中等大，近卵形。上側額鬃1對，下側額鬃2對或3對或以上；具內頂鬃、外頂鬃和頰鬃；單眼鬃細小或缺如。觸角顯長于顏面長。中胸背板黑色帶橙色或紅褐色區；介于縫后中黃色條和側黃色條之間的大部分區域、肩胛后至橫縫間的2大斑、背板中部前緣至黃色中縱條前端的狹縱紋均為黑色；肩胛、背側胛、縫前1對小斑均為黃色；縫后側黃色條終止于翅內鬃著生處或其后之處，縫后中黃色條淚珠狀；前翅上鬃、小盾前鬃和翅內鬃存在、背中鬃缺如。小盾片黃色，具黑色基橫帶，小盾鬃2對。后小盾片和中背片中部均為淺黃色或褐橙色，兩側帶暗色斑。翅斑褐色，前緣帶于翅端擴成1橢圓形斑，該斑約占據R4+5室寬度的1/3；dm-cu和r-m橫脈上均無橫帶；臀條寬闊，伸達后緣；A1+CuA2脈段長。足淡黃色，前足、中足和后足腿節暗色斑段占其各自腿節長的比例約為0%～30%。第2和第3腹背板的前部各具1黑色橫帶；第4和第5腹背板的前側部常具黑色短帶；黑色中縱條自第3腹背板的前緣伸達第5腹板后緣，第5腹背板具腺斑。（圖3、4）

圖3 南瓜實蠅背面

圖4 南瓜實蠅側面

經形態鑒定，2種實蠅的形態特征與資料中具條實蠅B.（Zeugodacus）scutellata 和南瓜實蠅 B.（Zeugodacus）tau一致。

2.2 DNA提取結果

根據試劑盒說明書提取得到DNA溶液經檢測，具條實蠅DNA溶液濃度為35.3μg/ml，A260/280=1.93；南瓜實蠅DNA濃度為29.6μg/ml，A260/A280=1.75。故所得實蠅標本DNA濃度及純度質量較高，可以進行下一步PCR反應。

圖5 實蠅標本各樣品PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

2.3 PCR擴增結果

以本研究中2種實蠅標本所提取的樣品DNA為模版進行的PCR擴增反應，擴增所得PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳。檢測結果如圖5所示，M泳道為DNAmarker（TAKARA，DL1000）1-4泳道在 685bp處有清晰條帶。其中1、2泳道為具條實蠅標本樣品，3、4泳道為南瓜實蠅標本樣品，5、6泳道為空白對照。

2.4 PCR產物測序及基因序列比對分析結果

將2種實蠅樣品DNA擴增產物測序獲得的線粒體COI基因序列，在NCBI及BOLDsystem數據庫比對結果顯示，具條實蠅樣品的COI基因序列同NCBI及BOLDsystem數據庫中具條實蠅標準序列的相似度最高分別為99%（GENEBANK登錄號KJ753946.1）、99.53%；南瓜實蠅樣品的COI基因序列相似度最高分別為99%（GENEBANK登錄號KJ753947.1）、99.85%。2種數據庫對比結果中，相似度最高的前20個已公開COI標準序列均為目標物種序列。結果表明，實驗用樣品擴增其COI基因序列,通過序列比對，可以證實為具條實蠅及南瓜實蠅。

3 結論與討論

本研究通過傳統形態鑒定方法，輔助以DNA條形碼技術，對2種常見有害實蠅進行了鑒定研究。實驗結果表明，傳統形態學鑒定結果同DNA條形碼分子鑒定結果一致，可以相互印證，對2種實蠅成功進行了鑒定。

植物檢疫實驗室對實蠅類害蟲的鑒定，不僅需要依靠檢疫人員具有豐富的經驗積累，也完全依賴對實蠅蟲體完整性的依賴。隨著分子生物學檢測鑒定方法的發展，利用DNA 條形碼技術建立的物種鑒定方法已廣泛應用于實蠅及各類有害生物的檢疫鑒定。本試驗在形態鑒定的基礎上，采用分子生物學方法，僅使用25mg蟲體材料，既能對樣品進行比對鑒定，是實蠅鑒定傳統形態學方法的良好補充和輔助。從DNA提取、PCR擴增到測序比對得到結果，僅需要3d，大大提高了植物檢疫實驗室檢疫鑒定的周期。特別是利用DNA條形碼技術，使用少量樣品材料未來可以對無法形態學鑒定的幼蟲、蛹及昆蟲殘體等進行初步鑒定，為植物檢疫人員提供了新的檢疫鑒定手段。

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