蜂蜜中金霉素殘留提取新方法的探討

任 釗 關世恒 劉紅偉 鄭純宇 付有利 李 娜 高火亮 王鋆坦

（河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司，河南 鄭州 450002）

金霉素（CTC）是一種對多種病原菌有較強的抑制作用的高效廣譜抗生素，廣泛應用于動物的各種傳染性疾病治療，食用含有金霉素殘留的動物肉類會引起人體健康危害，產生一些障礙性疾病。中國是世界第一養(yǎng)蜂大國，蜂產品資源相當豐富，在蜂產品的研究開發(fā)方面，盡管工作做了很多，目前我國主要蜂產品的工業(yè)化生產效率普遍低下，高新技術的精 、深加工產品非常少，附加值高的產品幾乎沒有[1,2]。但是世界其他許多國家對蜂類產品的質量要求卻越來越高，歐盟、美國等許多國家已明確禁止將此類抗生素用于生產動物源性食品[3]。

目前蜂產品中金霉素殘留的提取，一般的方法有溶劑萃取法、吸附法、沉淀法、離子交換法、膜分離技術、高效毛細管電泳技術、雙水相技術和反束膠萃取技術等，這些方法大多提取率低、耗時長、易污染，不易于實際的推廣應用[4,5]。本文采用溶劑提取脫水處理對蜂蜜中金霉素進行了探索，并用化學發(fā)光法進行檢測，該方法操作快捷、簡便，結果準確、可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂蜜產品購于鄭州市金水區(qū)某超市；實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為高純水。金霉素標準品購于省食品藥品檢驗所，金霉素（CTC）儲備液：稱取金霉素標準品0.01g放入50mL容量瓶中，緩慢加入0.1mol/L鹽酸至刻度，得到儲備液濃度為2×10-4mg/L。超靈敏管式發(fā)光儀（Lumat LB 9507，德國）；實驗室用超純水機（Water Purifier，四川）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

稱取10.0g蜂蜜待測樣品于250mL錐形瓶中，加入30mL無水乙醇、30g無水硫酸鎂，固定在振蕩儀上提取30min，以6000rpm離心20min，取上清液15mL，氮吹氮吹使溶劑揮發(fā)盡，最后用0.01mol/L稀鹽酸2.5mL，上機檢測。試樣3份，2份為空白樣品，1份加入適量的1×10-5mg/L金霉素使用液，以考查試樣處理效果。

1.2.2 樣品檢測

Lumat LB9507超靈敏管式發(fā)光儀采用兩個進樣泵噴射式加液方式。具體實驗條件：泵1進樣量100μl濃度為0.05mol/L的NaIO4；泵2進樣量100μl濃度為0.03mol/LH2O2；金霉素、空白和實驗篩選體系中有顏色的物質都通過手動進樣，加入量100μl，見示意圖（圖1）。

圖1 LB 9507檢測原理圖

1.2.3 標準曲線的繪制

以金霉素標準使用液濃度為橫坐標，以體系產生的相對發(fā)光值△I為縱坐標，繪制標準曲線如圖2、圖3。

圖2 低濃度標準曲線

圖3 高濃度標準曲線

1.2.4 樣品測定

用移液器量取待測樣品100μl，加入發(fā)光體系中，記錄相對發(fā)光值△I，代入標準曲線法得出金霉素含量。

2 結果與討論

2.1 化學發(fā)光體系的篩選

實驗中擬采用 “信噪比”（△I/I1）作為篩選體系的依據(jù)。實驗中金霉素標濃度為1×10-6mg/L，本實驗考察的化學發(fā)光體系有：魯米諾－高錳酸鉀體系、魯米諾-過氧化氫體系、亞硫酸鈉-過氧化氫體系、高碘酸鈉-過氧化氫體系、鐵氰化鉀-魯米諾體系、魯米諾-四價鈰體系、鐵氰化鉀-亞硫酸鈉體系、重鉻酸鉀-亞硫酸鈉體系、亞硫酸鈉-四價鈰體系、高錳酸鉀-亞硫酸鈉體系、銅氨絡離子-過氧化氫-CTMAB體系。實驗結果顯示：高錳酸鉀-亞硫酸鈉體系、高碘酸鈉-過氧化氫體系、銅氨絡離子-H2O2-CTMAB體系都可以作為檢測金霉素的檢測體系，其中高碘酸鈉-過氧化氫體系沒有顏色干擾，10s即可完成化學發(fā)光，在0.6s時產生最大發(fā)光值，隨后發(fā)光逐漸減弱，該發(fā)光動力學曲線如圖4。

圖4 NalO4-H2O2發(fā)光動力學曲線

2.2 介質的選擇及濃度的影響

實驗條件：金霉素標濃度為1×10-6mg/L，泵1進樣NaIO4，濃度為0.05mol/L，加入量100μl；泵2進樣，H2O2，濃度為0.03mol/L，加入量100μl；金霉素和空白，手動進樣，加入量100μl。NaIO4-H2O2化學發(fā)光體系一般在酸性溶液中較穩(wěn)定、較強，實驗選擇在處理樣品時加入一定濃度的H3PO4、HCl、HNO3、H2SO4等酸性溶液。實驗結果表明：稀鹽酸濃度在0.001mol/L增加至0.01mol/L時，體系的△I/I逐漸增加達到最大，稀鹽酸濃度從0.01mol/L增加至0.022mol/L時，體系的△I/I逐漸減小。因此，稀鹽酸濃度為0.01mol/L時，效果最好。

圖5 鹽酸濃度的影響

2.3 干燥劑的篩選

實驗室中常用的干燥劑有很多種，根據(jù)本實驗考察的干燥劑有：無水氯化鈣、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈣、無水碳酸鉀、氧化鈣等。實驗結果表明：無水硫酸鎂吸水容量大，速度快，且是中性化合物，對實驗的干擾性小，試樣稱取量為10g時，無水硫酸鎂用量從15g增加至30g時，樣品回收率顯著提高，可達92.2%，無水硫酸鎂用量從30g再增加40g時，樣品回收率走勢平緩，并未增加明顯。因此，干燥劑選擇無水硫酸鎂用量為30g時，效果最好。

圖6 干燥劑的影響

圖7 硫酸鎂用量的影響

2.4 提取溶劑的篩選

實驗室中常用的提取溶劑有很多種，根據(jù)本實驗考察的溶劑劑有：石油醚、正己烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、無水乙醇等。實驗結果表明：無水乙醇提取效率高，操作簡便，試樣稱取量與提取溶劑為2∶1增加1∶3時，樣品回收率顯著提高，可達91.8%，試樣稱取量與提取溶劑為1∶3增加1∶5時，樣品回收率走勢平緩，并未增加明顯。因此，提取溶劑選擇無水乙醇用量為試樣3倍時，效果最好。

圖8 提取溶劑的影響

圖9 無水乙醇用量的影響

2.5 提取時間的篩選

本實驗采用無水乙醇作為提取溶劑，提取效率高，價格便宜，操作簡便，氮吹濃縮過程容易揮發(fā)出，不產生溶劑殘留。實驗結果表明：使用無水乙醇震蕩提取時間從10min增加至30min時，樣品回收率顯著提高，可達92.6%，無水乙醇震蕩提取時間從30min增加至60min時，樣品回收率走勢平緩，并未增加明顯。因此，無水乙醇提取時間為30min時，效果最好。

圖10 提取時間的影響

2.6 離心時間、轉數(shù)的篩選

圖11 離心時間的影響

試樣中抗生素經過提取試劑震蕩提取后，采用離心方法使試樣固液，考查了離心時間、離心轉速對試樣提取后回收率的影響。實驗結果表明：離心時間從5min增加至20min時，樣品回收率顯著提高，可達90.5%，離心時間從20min增加至30min時，樣品回收率走勢平緩，并未增加明顯；離心轉數(shù)從4000r/min增加至6000r/min，樣品回收率顯著提高，可達90.6%，離心轉數(shù)從6000r/min增加至9000r/min時，樣品回收率走勢并未增加明顯，反而有所降低。因此，離心時間選擇20min、離心轉速6000r/min時，效果最好。

圖12 離心轉速的影響

2.7 條件指標優(yōu)化

實驗結果產生2個分段的線性范圍：金霉素濃度0～8×10-7mg/L、10～100×10-7mg/L范圍內與相對發(fā)光值△I有良好線性關系 ，方法檢出限達到10-8mg/L。精密度實驗RSD為為2.12%～2.74%，準確度實驗，樣品加標后回收率為92.6%～97.6%。

3 結論

本文探索了用溶劑提取對蜂蜜中金霉素提取方法進行研究，篩選了適合金霉素檢測的化學發(fā)光體系，研究發(fā)現(xiàn)：樣品以1∶3加入無水乙醇、無水硫酸鎂后，振蕩提取30min，6000rpm離心20min，吸取上清液15mL，氮吹使溶劑揮發(fā)盡，最后加入濃度為0.01mol/L稀鹽酸2.5mL，可以有效提高蜂蜜中金霉素殘留的提取率。該方法操作快捷、簡便，結果準確、可靠。

[1]張文文,周金慧,郭偉華,等.2014年國內外蜂產品質量安全研究進展[J].中國蜂業(yè),2015(6):19-24.

[2]李哲.獸藥殘留分析中樣品前處理技術研究進展[J].科研,2016,12(5):313.

[3]張亞欠.蜂王漿和牛奶中獸藥殘留分析方法研究[J].河北大學,2016.

[4]朱曉麗.蜂王漿中抗生素殘留檢測方法研究進展[J].工程技術(引文版),2016,3(40):20.

[5]閆小峰.四環(huán)素類抗生素殘留檢測方法研究進展[J].中國獸藥雜志,2010(5):47-50.