分析保護劑對中藥材桂皮中有機氯農藥殘留檢測基質效應的補償作用研究

(梧州出入境檢驗檢疫局，梧州 543002)

中藥材是中華民族自古以來防治疾病的傳統特色藥物,在中華文明的歷史進程中發揮了重要的作用，時至今日中醫中藥材仍然是患者去除疾病的重要手段之一。隨著現代農業技術的推廣，除部分中藥材為野生采摘外，大部分植物源性中藥材已實現人工育苗，種植。城鎮化的快速推進和工業化污染的日益加重，土地上農作物的安全、衛生狀況不斷引發全社會的持續關注，人們對農產品中農藥殘留危害性的認識進一步增強，中藥材中的農藥殘留分析顯得日益重要。有機氯農藥是一類曾被世界各國廣泛使用的高效廣譜殺蟲劑,屬于神經毒物和實質臟器毒物,可致癌，但由于它的分子結構穩定,在自然環境中不易降解，致使在禁用10 余年后,仍能在水域、土壤和生物體內找到殘留[1]。美國、日本、韓國、歐盟等國家及中國香港、臺灣地區均對中國出口中藥材中的有機氯殘留提出了限量要求[2]。

肉桂歷來是廣東、廣西兩地傳統大宗出口產品，產量占我國肉桂產量的95%以上，在中醫藥行業，肉桂有著悠久的藥用歷史，現存最早的秦漢時期的《五十二病方》中，關于肉桂的使用就有十三方[3]；相對于常見的中藥材樣品農藥殘留檢測，桂皮樣品有機提取液基質非常復雜且干擾化合物較多，含揮發性成分高，富含大量醛、醇類極性物質，主要成分為反式肉桂醛、反式鄰甲氧基肉桂醛、肉桂酸及部分烯類、醇類化合物[4，5]，檢測過程中若不考慮基質效應將會對檢測結果產生較大的影響，影響定量結果的可靠性。基質效應即樣品中除待測物以外的其他基質成分對待測物的測定產生影響，會導致檢測結果的準確性[6-7]。一些文獻中對水果、蔬菜、糧食中基質效應的報道較多[8-13]，對中藥材特別是芳香性中藥材如桂皮農藥殘留檢測中的基質效應的研究還未見報道。本實驗選取芳香性中藥材肉桂皮為研究對象，分析了在檢測肉桂皮有機氯農藥殘留過程中產生的基質效應，有針對性的提出加入分析保護劑以最大程度地減少基質效應。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫7890A氣相色譜儀(美國安捷倫公司)，微電子捕獲檢測器μECD及G4513A自動進樣器，安捷倫超高惰性襯管(5190-3165)；漩渦震蕩混合儀(美國TALBYS)；TDL-40B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；WK-1000A高速粉碎機(青州市精城醫藥設備制造有限公司)；氮吹儀、固相萃取裝置、六六六BHC(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC)、滴滴涕DDT(PP-DDE、OP-DDT、PP-DDD、PP-DDT)混合標準液(100μg/mL，美國Dr公司)、L-古洛糖酸-γ-內酯(L-Gulonic Aicdγ-Lactone，CAS:1128-23-0，純度98%)、3-乙氧基-1,2-丙二醇(3-E thoxy-1,2-propanediol，CAS No: 1874- 62- 0，純度98%)均購自上海安譜科學儀器有限公司；丙酮、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、石油醚(沸程60～90℃)均為色譜純；無水硫酸鈉經馬弗爐650℃灼燒4小時，于烘箱中120℃烘烤2小時，冷卻后密閉置于干燥皿保存備用。

固相萃取柱：CNWBOND SAX/PSA 500mg/500mg,6mL，CNWBOND Florisil柱500mg/6mL，均購自上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 儀器條件

色譜柱：DB-1701彈性石英毛細管柱(30m×0.35mm×0.25μm)；載氣：高純氮氣(純度99.999%)；進樣口溫度250℃；檢測器溫度300℃；尾吹流量：60mL/min.；柱流量：3mL/min；不分流進樣，進樣量：1μL；定量方法按峰面積外標法定量。

升溫程序：初始溫度100℃，以10℃/min.升至180℃，再以5℃/min.升至240℃，保持10min.。

1.3 樣品制備

為避免每次前處理過程添加標準溶液時引入的操作誤差及實驗器皿誤差，本實驗按以下方法制備模擬陽性樣品：肉桂皮樣品約300g，挑揀出雜質后制成約1cm×1cm碎塊，置于800mL大燒杯中，倒入500mL預先配置好的六六六、DDT混合標準溶液(正己烷定容，濃度為1.0μg/mL)，充分攪拌均勻浸泡24小時后放入通風櫥，抽風趕去燒杯中正己烷，在通風櫥中放置一張干凈牛皮紙，將燒杯中桂皮平鋪在牛皮紙上，繼續抽風至桂皮樣品干燥后用高速粉碎機粉碎后置于玻璃試劑瓶中備用。

1.4 六六六、DDT標準液制備

以正己烷為溶劑，將六六六、DDT混標液稀釋至10μg/mL，再精密吸取適量，配制成濃度為0.1μg/mL 、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL的工作液。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取

稱取0.5g肉桂皮樣品于15mL塑料離心管中，加入1mL蒸餾水充分濕潤30min，加入2g無水硫酸鈉，以石油醚∶丙酮=9∶1(體積比,下同)2mL×3次在漩渦混合儀上漩渦振蕩提取，每次3min，于離心機上離心2min(4000rpm/min)，合并3次上清液，待凈化。

1.5.2 凈化

SAX/PSA固相萃取柱上以濕法填入1cm高無水硫酸鈉，下接Florisil柱，以6mL正己烷淋洗小柱，棄去淋洗液，移入提取液，先以4mL正己烷分兩次洗脫，再以6mL正己烷∶乙酸乙酯=9∶1(體積比)分3次洗脫，控制提取液及洗脫液的流速在1mL/min左右，收集全部流出液于10mL帶刻度玻璃離心管中，40℃在氮吹儀上濃縮近干，用甲醇定容至1mL，上機測定，淋洗、上樣過程中需注意不能使液面流干。

2 結果與討論

2.1 分析保護劑的選擇

最簡單的解決方法是選擇不含待測目標物的空白樣品基質配制標準溶液，以此來補償標準溶液和樣品溶液中標物的響應，但該法在日常檢測工作中卻存在兩個問題：首先是不含待測目標物的空白基質樣品不易獲得，需在前期進行大量的篩選工作，耗費大量的人力物力及時間，產生大量的有機溶劑廢液污染環境；其次是實驗室每天接收的農產品、食品、中藥材等樣品種類五花八門，若需要匹配與每個種類基質相同的空白基質樣品，將大大增加日常工作量，影響了檢測工作效率的提高。在參考有關文獻的基礎上[14]，本實驗選定L-古洛糖酸-γ-內酯、3-乙氧基-1,2-丙二醇作為分析保護劑。稱取L-古洛糖酸-γ-內酯100mg，加入2mL水溶解，以甲醇定容至10mL，過0.45μm有機相濾膜后冰箱保存，濃度為10mg/L；稱取3-乙氧基-1,2-丙二醇100mg，以甲醇定容至10mL，冰箱保存,濃度為10mg/L。通過在實驗數據的對比并參考有關文獻[15，16]，發現3-乙氧基-1,2-丙二醇對基質效應的補償作用不及L-古洛糖酸-γ-內酯，故本實驗選定L-古洛糖酸-γ-內酯作為分析保護劑。

2.2 分析保護劑濃度的選擇

移取適量L-古洛糖酸-γ-內酯工作液，用甲醇配制成8個濃度的L-古洛糖酸-γ-內酯添加液：0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL，各取50μL加入按1.5樣品前處理方法得到的凈化液中，于漩渦震蕩器上充分混勻，上機測定，以L-古洛糖酸-γ-內酯添加液濃度為橫坐標，以目標物峰面積為縱坐標，比較濃度與峰面積關系，如圖1。

圖1 L-古洛糖酸-γ-內酯濃度與六六六、DDT峰面積響應關系

從圖1中可看出，在添加量恒定時，L-古洛糖酸-γ-內酯添加液的濃度為2.5mg/mL時，六六六、DDT的峰面積響應值達到了理想狀態，而隨著濃度的進一步提高，雖然峰面積有一定程度增加，但基線隨之大幅升高，從而給目標峰的積分帶來負面作用，故選定2.5mg/mL作為L-古洛糖酸-γ-內酯添加液的濃度。

2.3 分析保護劑的添加量

分別取10μL、30μL、50μL、70μL、90μL、110μL、130μL、150μL濃度為2.5mg/mL的L-古洛糖酸-γ-內酯添加液，加入按1.5樣品前處理方法得到的凈化液中，于漩渦震蕩器上充分混勻，上機測定，以L-古洛糖酸-γ-內酯添加量為橫坐標，以目標物峰面積為縱坐標，比較添加量與峰面積關系，如圖2所示，隨著添加量的增加，六六六、DDT的響應值在添加量在90μL處達到最大值，而繼續添加保護劑，六六六、DDT的響應值反而降低，說明過量加入保護劑，一方面容易在進樣口及襯管內表面造成更多的難揮發性有機物的累積，因為基質效應主要發生在從進樣口到色譜柱以及色譜柱到檢測器之間[17，18]，在配制L-古洛糖酸-γ-內酯工作液時需加入少量的水溶解，于凈化液中過量加入保護劑，進入色譜系統中的微量水分會削弱保護劑與目標物競爭襯管中活性點位時的競爭力，對目標物在ECD檢測器上的響應造成一定程度的影響。

圖2 L-古洛糖酸-γ-內酯體積與六六六、DDT峰面積響應關系

2.4 線性關系

分別以純溶劑、空白基質提取液配制濃度為0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL的標準溶液，各取1mL裝入進樣瓶，加入2.5mg/mL 的L-古洛糖酸-γ-內酯添加液90μL，在漩渦振蕩器上充分混勻，上機測定，考察純溶劑標準溶液添加保護劑、空白基質標準溶液兩者之間的線性關系，結果如圖3，兩者的相關系數非常接近，均達到0.99以上，表明在純溶劑配制的標準溶液中添加適量保護劑完全可以取代以基質提取液配制的標準溶液，盡可能消除因基質效應影響定量準確度的因素，大大提高了工作效率，避免產生大量的有機溶劑廢液污染環境。

圖3 溶劑標準溶液加保護劑、基質標準溶液兩者之間的線性關系

2.5 方法檢出限、回收率、精密度

取空白基質肉桂皮樣品0.5g，加入3個濃度水平的標準液，按照1.5節處理方法進行樣品前處理，按上述優化的保護劑L-古洛糖酸-γ-內酯濃度及添加量加入保護劑，進行測定，每個水平測定5次，計算加標回收率及相對標準偏差，結果見表1。結果表明，六六六的加標回收率為95.5%～98.0%，相對標準偏差為3.23%～7.59%，檢測限(以3倍信噪比計)為4.5×10-3～1.6×10-2mg/kg；DDT加標回收率為95.5%～100.5%，相對標準偏差為3.17%～4.36%，檢測限(以3倍信噪比計)為3.8×10-3～8.4×10-2mg/kg，說明本方法的準確度和精密度較高，重現性好，完全滿足農藥殘留分析的要求。

表1 樣品加標回收率及精密度(n=5)

3 結論

本實驗研究了L-古洛糖酸-γ-內酯作為分析保護劑對桂皮中有機氯農藥殘留檢測基質效應的作用，相比一般的植物性樣品，類似桂皮這種基質復雜、強極性干擾化合物較多的芳香性植物樣品，在日常檢測活動中若不考慮基質效應，將會影響定量結果的準確性，并對色譜柱和檢測器造成污染。本文提出的在標準溶液和凈化液中添加適量保護劑的檢測方法，對基質增強效應有良好的補償作用，較好的消除了基質效應對定量結果的影響，大大縮短了檢測周期，6種有機氯農藥的回收率在95.5%～100.5%之間，方法簡便快速，檢測周期短，準確性高，重現性好。由于大大減少了有機溶劑的用量，有利于檢測人員的身心健康與環境保護，適合制藥企業實驗室及執法口岸實驗室的檢測要求，對于其他復雜基質中藥材中有機氯農藥殘留的檢測具有較好的借鑒作用。

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