運用SAN++型連續流動分析儀測定水稻無機磷含量

(浙江大學生命科學學院植物所，植物生理學與生物化學國家重點實驗室，杭州 310058)

水稻無機磷含量是水稻磷吸收代謝能力的重要指標。很多水稻磷相關基因突變體研究中都涉及無機磷含量的測定[1]，還有很多磷相關突變體就是通過葉片無機磷測定來篩選和基因定位[2,3]，因此水稻無機磷的測定是水稻磷相關途徑研究的重要方法，其準確性將直接影響磷相關基因功能的研究。

目前水稻無機磷的測定主要采用吸光度法，樣品使用硫酸或者高氯酸消解后，采用孔雀綠法或者鉬藍法進行測定[4，5]。這些方法步驟較多，需要分液稀釋后逐個加入反應液，進行顯色反應，步驟繁瑣，耗時較多，尤其是樣品量很大時，準確度也得不到保證。連續流動分析儀是一種新型的分析儀器，自動化分析，具有操作簡單、結果準確等優點，目前已在不同領域發揮重要作用。如連續流動分析儀測定植物全氮、全磷、全鉀[6，7]；土壤中全氮、有效磷[8]；有機肥料中全氮[9]；稻米直鏈淀粉[10]；水質分析[11，12]等，但使用連續流動分析儀測定水稻無機磷含量尚未有報道。本研究應用SAN++型連續流動分析儀分析了不同水稻磷相關突變體的無機磷含量，并對儀器測定結果的準確度進行了分析，建立了一種快速、簡便、準確的測定方法。

1 材料與方法

1.1 方法原理

水稻組織破碎后，用5M硫酸提取無機磷，在酸性條件下，磷酸根與鉬酸銨形成銻磷鉬混合雜多酸，在酒石酸銻鉀的催化下，被抗壞血酸還原成鉬藍，在880nm比色測定吸光度，利用鉬藍質量濃度與吸光度呈正比定量測定。

1.2 材料與試劑

(1) 2mL離心管(國產)，15 ml離心管(國產)，小剪刀，10mL分液器，9mm定性濾紙；

(2) 連續流動分析儀(荷蘭SKALAR)，荷蘭SKALAR公司生產，配置自動進樣器；球磨儀(萊馳)，德國萊馳生產；

(3) 5 M硫酸：650mL Milli-Q水中緩慢加入272mL 98%硫酸(分析純)，并不斷攪拌，冷卻后定容到1000mL；

(4) 無機磷測定反應液：

反應液I：800mL Milli-Q水緩慢加入25mL 濃硫酸(分析純)，并不斷攪拌，定容到1000mL；

反應液P4：800mL Milli-Q水加入2mL FFD6(Skalar，cat.No：13909)，并不斷攪拌，定容到1000mL；

反應液C2：800mL Milli-Q水緩慢加入40mL濃硫酸(分析純)，并不斷攪拌，定容到1000mL；

反應液G：800mL Milli-Q水加入18 g抗壞血酸(分析純)，并不斷攪拌，加入20mL酒石酸銻鉀母液，定容到1000mL，4℃保存，最多保存2周，可根據測定工作量配置合適體積；

反應液E：800mL Milli-Q水加入4.8 g鉬酸銨(分析純)，并不斷攪拌，加入40mL 酒石酸銻鉀母液，并加入2mLFFD6，定容到1000mL，4℃保存，最多保存2周，可根據測定工作量配置合適體積；

(5) 無機磷母液(1000 mg/L)：800mLMilli-Q水加入4.875 g NaH2PO4·2H2O(分析純)，并不斷攪拌，定容到1000mL；

(6) 酒石酸銻鉀母液：80mL Milli-Q水加入300 mg酒石酸銻鉀(分析純)，并不斷攪拌，定容到100mL，4℃保存；

1.3 植物材料

(1)水稻秧苗。野生型Nipponbare(Nip)種子露白后種到網紗板上，正常營養液培養21天，每3天換一次營養液。

(2)取21天苗齡水稻倒二葉和根進行測定。

1.4 樣品處理

(1)根據測定樣品數量，取國產2mL離心管并編號，每個離心管稱重并記錄。

(2)取水稻倒二葉或根，盡量剪碎，并放入稱重編號的2mL離心管中，取完樣品后，離心管和樣品一起稱重，并記錄，算出樣品質量。樣品50～100 mg為宜。

(3)加入氧化鋯珠子(直徑5mm，淘寶有售，鐵珠子會被硫酸腐蝕)，并加入500μL5M硫酸，使用球磨儀24 frequency 1/s 頻率震動研磨2min，磨碎葉片，直至成為均勻勻漿(可多次打樣)。

(4)使用分液器在每個磨碎的樣品中加入5mL Milli-Q水，并轉移到15mL離心管中，顛倒混勻。并使用500 μL 5 M硫酸和5mL Milli-Q水做2個空白對照。

(5)按照常規方法折疊9mm定性濾紙，將上述裂解液使用濾紙過濾到連續流動分析儀自動進樣器配套的進樣管中。

(6)過濾好后，按照順序放到自動進樣器相應的位置上，2個空白首先放置。

1.5 標準溶液配置

使用100mL容量瓶，加入80mL反應液I后，分別加入125 μL、250 μL、500 μL、1000 μL、2000 μL、3000 μL無機磷母液，用反應液I稀釋至刻度，得到1.25 mg/L，2.5 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L梯度的標準溶液。

1.6 上機測定

(1)開機后，所有管路連接Milli-Q水，清洗管道5min后，5條進液管道分別加到裝有反應液I、P4、C2、G、E的反應瓶中，進行預反應，此時打開“FlowAccess”軟件，設定到Total P測定的程序上，并打開讀數頁面，此時讀數應在70～75萬之間。

(2)在流動分析儀預熱過程中，分別將6個標準溶液倒入進樣管中，體積至少3mL，否則會因為液面太低吸不到標液。同時按照測定樣本的數目，準備好漂移校準液(20 mg/L標準溶液)，每測定10個樣品，測一次漂移校準液，每次吸取750 μL左右，每個進樣管吸5次。

(3)當流動分析儀進樣系統各個管道流速均一，基線穩定時，軟件中點擊Start按鈕，開始測定。

(4)全部測定完成后，根據測定結果和樣品質量，按照式(1)計算出所測樣品中的無機磷濃度ω：

ω=(ρ×V) / (m×1000)

(1)

式中：

ρ—試樣溶液中的無機磷濃度，mg/L；

V—試樣溶液總體積，5.5mL；

m—稱取水稻葉片的質量，g。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

按照標準配置標準溶液后，使用連續流動分析儀測得的標準曲線圖和峰形圖見圖1和圖2。從圖1可以看出，標準溶液濃度在0～30 mg/L時，無機磷濃度與測定峰值之間形成很好的線性關系，相關系數可以達到0.9999，擬合方程為：y= 59188.13x- 30762.91(r2=0.9999)，其中y為標準系列峰高度，x為標準系列磷濃度(mg/L)。

圖1 標準曲線圖

圖2 標準溶液峰形圖

從峰形圖可以看出，標準溶液曲線峰形平滑，沒有雜峰，這說明反應時間和其他反應條件均在比較適宜的范圍內，符合試驗穩定性要求。

2.2 精密度檢測

用質量濃度分別為1 mg/L，6 mg/L，15 mg/L的3個代表低、中和高質量濃度的樣品各測定10次，計算相對標準偏差(表1)。精密度RSD在0.86%～3%之間。

表1 精密度測定結果

2.3 加標回收率實驗

配置濃度為15 mg/L的磷標準溶液，取5 ml樣品溶液分別加入1mL不同濃度的磷標準溶液，定容到10mL后混勻，使用連續流動分析儀測定其濃度，根據濃度計算加標回收率，結果見表2。從表2可以看出，測得加標回收率在96.8%～108.5%之間，平均加標回收率為102.6%，說明該方法符合實驗準確度要求。

表2 加標回收率實驗結果

2.4 已知磷相關材料磷測定分析

分別對正常營養液(200 μM磷)和低磷營養液(10 μM磷)處理14天的水稻葉片和根的無機磷含量進行了測定，結果見圖3。從結果可以看出，無論是正常還是低磷處理的葉片，使用連續流動分析儀測定無機磷，都能得到好的結果。

圖3 正常和低磷條件下無機磷測定

根據文獻報道，pho2、PHR2(O)、spx1、spx2、spx4等水稻材料無機磷含量高于野生型，phf1水稻材料無機磷含量低于野生型。使用連續流動分析儀對上述磷相關材料葉片進行無機磷測定分析，結果見圖4。

圖4 不同磷相關材料葉片無機磷測定

根據流動分析儀測定結果(圖4)，無機磷含量高的磷相關突變體pho2、PHR2(O)、spx4等材料無機磷含量都顯著高于野生型，其中pho2材料磷含量最高，PHR2(O)次之，spx4材料磷含量比PHR2(O)要低；磷含量低的突變體phf1材料無機磷含量比野生型低，測定結果及趨勢與文獻報道一致[1-3]。上述結果表明，連續流動分析儀可以用來進行磷相關材料的無機磷測定。

3 討論

SAN++型連續流動分析儀測定無機磷濃度，使用的是鉬銻抗法，該方法顯色快，顏色穩定，靈敏度較高，對干擾離子的允許量較大，從標準曲線、準確度分析和加標回收結果來看，該方法標準曲線峰形平滑，回歸線性好，精密度在0.86%～3%之間，能夠滿足實驗需要。而且雖然鉬銻抗法測定磷濃度沒有孔雀綠法靈敏度高，但是水稻葉片和根部的無機磷含量并不低，使用孔雀綠法時，反而會因為靈敏度太高而需要高倍稀釋，造成不便。流動分析儀使用自動進樣裝置，在連續、大批量無機磷測定時省時、省力，而且避免了人工操作帶來的誤差，在目前基因組學、表型組學研究中大有用途。

連續流動分析儀在使用過程中，需要不定期進行維護、清洗，否則會出現問題。首先儀器進樣管道要定期使用次氯酸鈉清洗，而且要根據使用頻率不定期更換，否則會影響測定準確度，嚴重時會導致峰形變差，甚至會出現不起峰現象；其次反應試劑配置要準確。由于反應試劑中需要使用濃硫酸，為了安全起見，反應I、C2可以一次性大量配置，多次分裝使用，避免多次接觸濃硫酸，反應液G、E由于是反應底物和催化劑，對結果影響大，需要仔細配置，而且因為試劑穩定性原因，每次少量配置，低溫保存，最多放置2周。

4 結論

San++連續流動分析儀測定水稻無機磷操作簡單、分析速度快、準確度高，尤其是大量測定時更加具有不可替代的優勢，在水稻磷營養相關研究中應用前景廣闊。

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