基于Py-GC-MS/MS技術的高寒草原土壤有機質不同組分指紋特征研究

陳秋宇,吳應琴,雷天柱,斯貴才,張更新

1 中國科學院青藏高原研究所,中國科學院高寒生態(tài)學與生物多樣性重點實驗室,北京 100101 2 中國科學院大學,北京 100049 3 中國科學院地質與地球物理研究所蘭州油氣資源研究中心,蘭州 7300005

土壤有機質(Soil Organic Matter,SOM)是土壤中由動植物殘體以及微生物殘體及其分泌物組成的混合物,其結構復雜,異質性強。由于土壤有機質復雜的結構與組成,所以對其的研究通常與分組技術密切相關。土壤有機質密度分組技術始于20世紀80年代[1],該技術的原理為：利用土壤在密度為1.6—2.5g/cm3的重液中的沉降作用將土壤有機質分為不同的組分。密度較小的有機質主要由動植物殘體、菌絲體、孢子、單糖、多糖以及半木質素構成[2- 3],是介于植物與土壤腐殖質之間的產物,具有較高的周轉速率,比全土周轉快3—11倍[4],為中等分解速度的有機碳庫。這一部分土壤在全土中含量較少,僅為土壤總重量的1.8%—3.2%,但其碳含量達到土壤總有機碳的15%—32%[5],是微生物重要的碳源,易受到微生物及土壤酶的侵入,因此具有較快的分解速率。密度較大的有機質主要是與土壤礦物緊密結合的腐殖質類物質,為土壤有機質的主要組成部分,含量高達70%—80%[2],其C/N比較低,分解轉化速率極慢。正是由于不同組分的土壤有機質具有不同的性質,因此人們常將該技術應用于評價土地利用、管理措施、植被類型對碳周轉、碳貯量、養(yǎng)分有效性、物理保護、團聚過程的影響中[6- 8]。

熱裂解氣相色譜質譜聯(lián)用技術(Py-GC-MS/MS)是近幾年興起的專門用于研究熱裂解機理的有效方法[9- 10]。該技術首先將樣品置于嚴格控制條件的熱解器中進行加熱,使得大分子化合物迅速裂解成可以揮發(fā)的小分子化合物,隨后小分子化合物由載氣帶入氣相色譜/質譜儀中進行分離和鑒定,最后通過氣相色譜/質譜圖的特征來推斷樣品的組成、結構及其化學特征[11]。通過對熱解產物定性定量的分析及其與裂解條件(溫度、時間等)之間的相關性研究,可以推導熱解產物與原樣品組成、結構和物理化學性質之間的內在聯(lián)系。該技術優(yōu)點顯著,即：快速、靈敏、需樣量少等,因此被廣泛應用于聚合物科學、微生物學、生物工程及地球化學等領域[12]。之前對土壤有機質的研究主要集中在土壤總碳量的估算,但土壤有機質結構組成較為復雜,僅僅從總碳量的估算難以得知其來源及降解過程,因此從分子水平對土壤有機質進行研究可以補充總碳研究中的短板。土壤有機質分子水平的研究可以確定具體化合物的種類及其含量,并且將其作為植物或者微生物的指紋譜圖,例如土壤中的特征生物標志物可以區(qū)分有機質的地上或地下貢獻、裸子植物源或被子植物源或是微生物源等[6- 13]。

青藏高原是世界最高、中國最大的高原,廣泛分布著高寒草原和高寒草甸土壤。草原生態(tài)系統(tǒng)作為最脆弱的生態(tài)系統(tǒng),對全球及區(qū)域環(huán)境的變化非常敏感[14]。之前,對高寒生態(tài)系統(tǒng)的研究主要集中在土壤總碳及總氮量的研究,有關分子水平的研究較少。因此,從分子水平對青藏高原高寒土進行研究有利于進一步了解該區(qū)域碳循環(huán)受到區(qū)域的變化、自然環(huán)境的變化以及人類活動的影響。因此,本文將采用熱裂解氣相色譜質譜聯(lián)用(Py-GC-MS/MS)技術,來研究高寒草原土壤5個密度組分之間的熱解指紋差異。

1 研究區(qū)域概況與研究方法

1.1 研究區(qū)域概況

本研究地點為青藏高原納木錯地區(qū),位于青藏高原腹地,為典型的半干旱高原季風氣候區(qū)。該地區(qū)夏、冬兩季分別受印度季風與西風帶控制,降水多發(fā)生在5—9月,多年平均降水量為410mm,年平均氣溫為-0.6℃[15]。該地區(qū)植被類型為高寒草原,主要優(yōu)勢種為紫花針茅(Stipapurpurea)和大花嵩草(Kobresiamacrantha)等[16]。

1.2 土壤樣品采集

本試驗在中國科學院納木錯綜合觀測站(30°46′44″N,90°59′31″E)開展相關研究。2013年8月,在納木錯典型高寒草原地區(qū)選取1m×1m的小樣方,每個樣點用土鉆通過蛇形采集0—15cm土壤,過2mm篩后混合在一起,共3個重復。采集后的樣品空運回北京,風干后進行后續(xù)實驗。

1.3 分析方法

1.3.1 密度分級提取

密度分組所用重液為NaI溶液,采用Gregorich 和Ellert[6]所描述的方法：將3個重復樣品混合在一起,稱取10g混合樣加入30mL 密度為1.6g/cm3的NaI溶液,在120rpm下振蕩30min,之后在2330g下離心20min,漂浮物過0.7μm玻璃纖維濾膜(Whatman GF/F, 0.7μm)。回收濾膜上的物質用去離子水清洗至鹽濃度<50Ms/cm。上述所有步驟重復3次,以確保土壤的有效分離。配制不同密度的NaI溶液,將土壤分為5個組分,分別為：F1(密度為小于1.6g/cm3)組分、F2(密度為1.6—1.8g/cm3)組分、F3(密度為1.8—2.0g/cm3)組分、 F4(密度為2.0—2.25g/cm3)組分以及F5(密度大于2.25g/cm3)組分。將獲得的各組組分在80℃下烘至24h。干燥后的土壤組分進行研磨,使樣品中各成分混合均勻,之后將研磨好的樣品保存留待上機測定。

1.3.2 熱裂解氣相色譜質譜(Py-GC-MS/MS)分析條件

熱裂解氣相色譜質譜(Py-GC-MS/MS)分析首先是在熱解器中進行,熱解器接口直接與氣相色譜/質譜相連接。其中,熱解儀為：PY3030D；色譜質譜儀器型號為：Agilent 7890型氣相色譜/7000B型三重四極桿質譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)及Agilent 氣相色譜工作站。在分析過程中,稱取研磨后的土樣約5mg放入熱解進樣杯中,并向樣品中加入內標：氘代菲和C24D50,以待后續(xù)對裂解產物進行定量分析。GC-MS 分析色譜條件為：恒流模式,以氦氣為載氣,色譜柱為HP- 5 (100m×0.32mm×0.25μm)。升溫程序：初始溫度40℃, 以1℃/min速率升至100℃, 再以3℃/min 升至280℃, 恒溫 25min；進樣口溫度為300℃。質譜條件：采用 EI, 70eV, 離子源溫度 230℃, 四極桿溫度150℃, 全掃描, 掃描范圍為50—550amu。

1.4 統(tǒng)計分析

納木錯土壤不同組分各化合物的含量、不同化合物之間的比值的數(shù)據(jù)整理及計算在Excel種完成,使用R語言進行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA),繪圖在SigmaPlot中完成。

2 結果與分析

2.1 不同密度組分樣品Py-GC-MS/MS的指紋特征

本研究共對150種熱解產物進行定性定量分析,詳細化合物信息見表1。土壤中的化合物類型主要是碳水化合物、含氮化合物、含磷化合物以及木質素等。因此,為了便于研究,本文將熱解產物根據(jù)其相似的化學性質進行分組,包括：烷烴、烯烴、脂肪酸、芳烴、多環(huán)芳烴、木質素、酚類物質、多糖、含氮化合物和幾丁質。

表1 本研究中土壤有機質的熱解產物

續(xù)表化合物名稱Compound name編號Code相對分子質量Relative molecular mass特征離子碎片Characteristic ion fragment出峰時間Time/min酚類化合物 Phenols苯乙酮 AcetophenonePh112077+10511.29苯酚 PhenolPh29466+9412.1752-甲基苯酚 2-methylphenolPh3108107+10814.583-十五烷基苯酚 Phenol, 3-pentadecylPh4108107+10815.389x,x-二甲基苯酚 x,x-dimethyl-phenolPh5122107+12218.938氧基甲基苯酚 MethoxytrimethylphenolPh616616631.696二甲基苯酚 Dimethyl-phenolPh720657+19125.146多糖化合物 Polysaccharide compound乙酸 Acetic acidPs160601.4642-丙烷2-酮四氫呋喃 2-propan-2-one tetrahydrofuranPs27257+721.734(2H)-呋喃-3-酮 (2H)-furan-3-onePs384842.2762-甲基呋喃 2-MethylfuranPs48253+822.3972,3-二氫-5-甲基呋喃-2-酮 2,3-Dihydro-5-methylfuran-2-onePs59855+983.3242,5-二甲基呋喃 2,5-dimethylfuranPs69695+963.493糠醛 2-FuraldehydePs79695+963.593呋喃甲醛 3-FuraldehydePs89695+963.745二氫-3-甲基-2(3H)-呋喃酮 Dihydro-3-methylene-2(3H)-furanonePs99868+984.032反式1-丁基-2-甲基環(huán)丙烷 Trans 1-butyl-2-methylcyclopro-panePs1011256+705.3012-乙酰基呋喃 2-acetylfuranPs1111095+1105.7645-甲基-2-糠醛 5-methyl-2-furaldehydePs12110109+1105.933麥芽酚 MaltolPs1312671+1268.729左旋葡萄糖酮 LevoglucosenonePs141261268.988甲基苯并呋喃 MethylbenzofuranPs15132131+13215.856左旋葡聚糖 LevoglucosanPs1617017019.433左旋半乳糖 LevogalactosanPs1716216221.427左旋甘露聚糖 LevomannosanPs1816216221.672二苯并呋喃 DibenzofuranPs19168139+16829.757含氮化合物 N-compounds吡咯 PyrroleN167672.073吡啶 PyridineN27952+792.733二甲基(1H)吡咯 (1H)-pyrrole, dimethylN39695+963.593x,x-二甲基吡啶 x,x-dimethyl-pyridineN4107106+1078.297腈/苯甲醛肟 Benzonitrile/benzaldehyde oximeN510376+10311.57吲哚 IndoleN611790+11711.9261h-吲哚-3-乙酰胺 1h-indole-3-ethanamideN713113116.053喹啉 (Iso)quinolineN8129102+12918.742二酮二吡咯 DiketodipyrroleN918618635.453幾丁質 Chitin甲酰基吡咯 2-FormylpyrroleChi195953.593乙酰氧基吡啶 AcetoxypyridineChi213795+13719.243

FA：脂肪酸,Fatty acids；Ar：芳烴,Aromatic；B：苯,Benzene；Pa：多環(huán)芳烴,Polyaromatic；Lg：木質素,Lignin；Ph：酚類化合物,Phenol；Ps：多糖,Polysaccharide；N：含氮化合物,N-compound；Chi：幾丁質,Chitin

圖1為5個組分的熱解總離子流圖。從總離子流圖中,可以清晰的看出5個組分在含量以及化合物組成中有明顯差別。F1組分峰強最強,單位有機質含量最多；F2、F3和F4 3個組分總離子流圖較為相似,單位有機質含量相對較多；而F5組分總離子流圖與前4個組分相比明顯不同,其峰強最小,單位有機質含量最少。

圖1 不同密度土壤有機質組分總離子流圖Fig.1 The typical ion chromatograms of five different density componentsF1：組分1,Fraction 1；F2：組分2,Fraction 2；F3：組分3,Fraction 3；F4：組分4,Fraction 4；F5：組分5,Fraction 5

2.2 不同密度組分樣品中各化合物含量

5個組分化合物含量之間的差異在表2中呈現(xiàn)。烷基類化合物主要來源于土壤和植物的表面蠟質層以及維管束植物的保護層[17]。短鏈正構烷烴和烯烴(n<20)主要來源于微生物產物,它們?yōu)槲⑸锏闹|碎片或是熱解過程中由長鏈烷烴斷裂而來；中鏈正構烷烴和烯烴來源于植物的生物聚合物(如角質和軟木脂)以及微生物,但通常植物的貢獻占主導地位。在5個組分中,短鏈烷基類化合物與長鏈烷基類化合物的變化趨勢相同,均呈現(xiàn)為：F1中含量最高(分別為：24.47%,4.77%),隨后在F2、F3和F4組分中呈減少趨勢,在F5中又有所增加,可達到20.18%與4.07%。

脂肪酸是構成生物體有機成分之一,具有高度的生物專一性,可以用來判斷沉積物和土壤中有機質的來源[18- 20]。不同來源的脂肪酸具有不同的分布特征。通常,長鏈飽和脂肪酸(C20—C32)來源于高等植物蠟質部分,最大濃度為C24和C26；短鏈脂肪酸(C14—C18)主要來源于微生物[18- 20]。從F1到F5組分中,脂肪酸含量呈現(xiàn)減少的趨勢,由3.17%減少至1.2%。

芳烴與多環(huán)芳烴在5個組分中呈現(xiàn)累積的趨勢,其中在F1組分中含量最少(分別為：22.34%與3.05%)。芳烴通常被認為是蛋白質的熱解產物[21],可能來源與微生物[22]或者燃燒后的產物[23]。多環(huán)芳烴可能來源于脂肪族類化合物在熱解反應中的環(huán)化反應[24]或者燒焦物質[23]。由于其特殊的化學結構使其具有較強的穩(wěn)定性,對土壤中的微生物具有抑制作用。

表2 不同密度組分中化合物的百分含量/%

F1：組分1,Fraction 1；F2：組分2,Fraction 2；F3：組分3,Fraction 3；F4：組分4,Fraction 4；F5：組分5,Fraction 5

在熱解產物中確定了7種酚類物質,雖然該化合物數(shù)量較少,但其相對貢獻很大。這類化合物來源于蛋白質、木質素以及纖維素。事實上,酚類物質及木質素大量存在于表層土中,因為在表層土中新鮮枯枝落葉的輸入較大,有機質含量相對較高。

單糖和多糖為土壤中主要的碳水化合物。游離的單糖為微生物代謝產生,而且極易被微生物利用,因此這類物質在土壤中的含量極少,所以土壤中的碳水化合物多以多糖的形式存在。土壤中的多糖不僅來源于植物的降解,也來自于微生物的貢獻。土壤多糖中的木糖和阿拉伯糖主要來自于植物多糖；而微生物多糖則以葡萄糖、脫氧六碳糖、半乳糖、甘露糖等為主。呋喃、糠醛多來自于埋藏土；這類化合物在土壤中的停留時間較長[27],其原因是這類物質在土壤有機質的分解及腐殖質化的過程中會再次循環(huán)利用[6]。在5個組分中,多糖隨著密度的增大呈現(xiàn)輕微的積累趨勢。

土壤中的含氮化合物包括蛋白質、多肽以及氨基酸。它們在土壤中可以與土壤礦質表面相互作用而使其穩(wěn)定性增強[28]。肽類物質在土壤礦質表面的吸附特別是與黏粒的強烈吸附使得蛋白質受到保護。理論表明,從砂粒到黏粒級,表面的吸附作用變強,含氮化合物更傾向于在小粒級庫中積累。

幾丁質衍生的熱解產物主要是特殊的含氮化合物的片段。幾丁質通常來自于真菌或是節(jié)肢動物[29]。在5個組分中,幾丁質的含量均較少,少量的幾丁質可能來源于節(jié)肢動物骨骼的殘余物。

2.3 不同密度組分降解難易性的差異

如表3所示,F1—F4組分在土壤中所占比例較少,F5最高為98%,是土壤中主要的組成部分。F1組分含量雖少(0.13%),但其熱解有機質的含量卻相對較高,可達5.7%。從烷烴與烯烴、多環(huán)芳烴與芳烴以及酚類與木質素的比值上看,5個組分呈現(xiàn)增加的趨勢,由于烷烴相對較于烯烴、多環(huán)芳烴相較于芳烴以及酚類化合物相較于木質素而言,降解難度大,因此使用它們的比值來衡量5個密度組分降解的難易程度。此外,對于短鏈烷基類化合物(C≤20)與長鏈烷基類化合物(C>20)的比值而言,前4個組分呈增加趨勢,并且大于F5組分。

由于5個組分之間的關系不易直觀比較,因此應用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)來比較不同密度組分之間的差別。其中,PC1權重最大,為79.66%,PC2權重次之,為12.64%,二者累積貢獻率為92.3%,因此本文只對PC1、PC2進行分析(圖2)。分析表明,F2、F3與F4 3個組分性質較為相近,與F1和F5 2個組分有明顯差異。

表3 不同密度組分土壤有機質之間差異

烷烴/烯烴：烷烴含量與烯烴含量的比值；短鏈烷烯烴(n≤20)/長鏈烷烯烴(n>20)：n≤20的烷烯烴含量與n>20的烷烯烴含量比值；多環(huán)芳烴/芳烴：多環(huán)芳烴含量與芳烴含量的比值；酚類/木質素：酚類含量與木質素含量的比值

圖2 不同密度組分主成分分析(PCA)圖Fig.2 Principal components analysis (PCA) of different groups

3 討論

3.1 五個密度組分之間的差異

本文旨在使用Py-GC-MS/MS技術來研究高寒草原土壤不同密度組分的之間的指紋差異,系統(tǒng)的分析了150種具體化合物的種類與分布。在國內土壤有機質分子領域相關研究開展甚少的情況下,本文所提到的實驗方法對研究土壤有機質的來源和降解具有一定的啟示意義。首先,從5個組分的總離子流圖(圖1)中,可以宏觀的看出5個組分之間存在一定的差異；隨后在主成分分析(圖2)中,可進一步觀測到,在5個組分中,F2、F3與F4 3者性質更為相近,并且與F1和F5組分之間有較大差異。

5個組分化合物含量的變化呈現(xiàn)以下趨勢(表2)：(1)木質素及脂肪酸含量的減少；(2)芳烴與多環(huán)芳烴的累積,以及(3)多糖與含氮化合物的增加。F1組分主要為植物碎屑,隨著土壤密度的增大,植物碎屑逐漸減少,土壤有機質與土壤中的黏粒和粉粒形成復合體,因此木質素的含量呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢；同時長鏈脂肪酸多來源于植物,同樣呈現(xiàn)減少趨勢。有研究表明,短鏈烷基類化合物來源于微生物或者是在熱解過程中由長鏈烷基類化合物斷裂而來,在5個組分中,該類化合物呈現(xiàn)先減少(24.47%—9.71%),隨后在F5組分(20.18%)中又增加的趨勢,其原因可能為在F1組分中含有較多的植物信息,在熱解的過程中該組份中的長鏈烷基類化合物被斷裂為短鏈烷基類化合物被檢測出來,而F5組分本身含有較少的植物物質,因此其中較多的短鏈烷基類化合物說明該組份本身含有較多的微生物信息。芳烴與多環(huán)芳烴在土壤中屬于降解難度較大的有機化合物,不僅因為其復雜的分子結構,同時因為在土壤中能分解這兩類化合物的微生物含量很少,因此這兩類化合物在土壤中會呈現(xiàn)逐漸累積的趨勢。如表2所示,芳烴與多環(huán)芳烴均呈現(xiàn)為增加趨勢,這表明隨著土壤密度的增大,難降解的物質逐漸累積,致使F5組分降解難度增大。多糖與含氮化合物在5個組分中呈現(xiàn)逐漸累積的現(xiàn)象,造成該現(xiàn)象的原因可能是隨著土壤密度的增大,土壤中微生物的指紋信息逐漸增加。

飽和化學鍵相對于不飽和化學鍵、多苯環(huán)結構相對于單苯環(huán)結構而言降解難度均增大,因此本文旨在用烷烴與烯烴、多環(huán)芳烴與芳烴的比值來進一步說明5個組分之間的降解難易性。比值結果顯示(表3),烷烴/烯烴與多環(huán)芳烴/芳烴在5個組分中均呈現(xiàn)增加的趨勢,這也進一步驗證了上述提到的隨著土壤密度的增加,難降解的物質逐漸增加,降解的難度逐漸增大。同時,酚類化合物主要來源于木質素,是由木質素分解轉換而來,在5個組分中酚類與木質素的比值也呈現(xiàn)增加趨勢,由此進一步猜測對于F1而言主要為新鮮輸入的有機質,而隨著密度的增加,新鮮的有機質被進行降解改造,致使最后存在于F5組分中的有機質是經過長期改造而最終形成的穩(wěn)定復合有機質。

綜上所述,F1組分主要由植物碎屑組成,雖然在土壤中含量較少,但是含有較高的有機質成分,這一部分含有較多易降解的物質,但是由于輸入到土壤中的時間較短,使其被外界改造的程度較低,屬于“較為新鮮的有機質”；F2、F3和F4 3個組分組成相似,可視為同一種組分,該組份的含量及有機質含量均較少,處于有機質被分解轉化的過渡階段,屬于被外界“部分改造的有機質”；F5組分是土壤中的主要組成部分,該組份在土壤中存在的時間較長,被外界改造的程度較高,含有較多難降解的物質。對于土壤有機質來說,有3種形式會使其變穩(wěn)定,第一種：化學過程,例如與金屬離子形成沉淀；第二種：生化頑固,即存在不易于被微生物分解的某些結構的化合物；第三種：物理保護,土壤有機質與土壤中的黏粒和粉粒形成復合體,使微生物無法接觸到可以降解的有機質從而對土壤有機質進行保護。正是由于被多次的改造,使的F5組分中含有較多的難以被降解的物質,因此該組份屬于“深度改造的有機質”。

3.2 高寒草原土壤有機質與其他非高寒土壤有機質之間的差異

研究表明,密度小于2g/cm3土壤通常被稱為輕組有機質。這一部分有機質通常占土壤質量的0.03%—8.2%,而有機碳氮的占土壤總有機碳氮的含量高達48%與32%。但不同的土地利用類型差異較大,農田輕組含量較低,為0.18%—2.39%,輕組有機碳占總有機碳的比例為1%—25%；草地和灌木分別為0.13%—8.24%和1.8%—3.2%,輕組有機碳占總有機碳的5%—48%；森林較高,為0.6%—14.7%,輕組有機碳占總有機碳的4%—63%[30]。本文所選用的青藏高原納木錯草原土壤的輕組含量符合上述標準,但有機質含量相對較低,原因可能為該地區(qū)具有特殊的生態(tài)環(huán)境,高海拔與寒冷的溫度使其有機質的含量較低。此外,隨著近年來全球變暖趨勢的日益突出與人類活動的不斷加劇,該地區(qū)的生態(tài)環(huán)境受到了極大的影響,使得該地的高寒草甸土壤處于極度退化的階段,造成有機質流失,含量減少的情況。

4 結論

本實驗研究的高寒草原土壤有機質的不同密度組分之間具有一定的差異。首先,在土壤組成方面：F5組分為高寒草原土壤的主要組成部分,含量高達98%；而F1組分雖然在土壤中所占比例較少,但其單位質量有機質含量相對較高。其次,在化合物組成方面：隨著土壤密度的增加,木質素含量在F1組分(該組份主要由植物碎屑組成)中含量最高,此后隨著密度的增加逐漸減少；芳烴與多環(huán)芳烴這類難降解的物質逐漸積累；同時,微生物來源的多糖與含氮化合物也呈現(xiàn)增加的趨勢,使得F5組分含有更多的微生物指紋信息。

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