木薯不同發育期塊根基因組DNA甲基化變化分析

薛晶晶 陳松筆

（中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所 農業部木薯種質資源保護與利用重點實驗室，儋州 571737）

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要內容之一，在植物生長發育、防御、逆境脅迫等方面起著極其重要的作用［1］。DNA甲基化現象在高等植物中普遍存在，但不同植物種類甲基化水平存在差異，一般基因組DNA的30%-50%胞嘧啶處于甲基化狀態［2］。其中大部分的甲基化都發生在CpG二核苷酸和CpNpG 三核苷酸中，其他位點較少［1］。植物中DNA甲基化修飾主要發生在轉座子和重復序列上，主要作為基因組防御系統來維持基因組的穩定，一方面沉默內源的轉座子等“自私元件（Selfish DNA elements）”，另一方面可以抵抗外源病毒的入侵［3］。作為表觀遺傳的重要修飾途徑之一，DNA甲基化與基因表達調控［4］、基因組印記［5］和轉基因沉默［6］等生物學過程密切相關。Zilberman等［3］指出基因轉錄受甲基化影響，輕度甲基化的基因適量表達，本身發生去甲基化的基因表達將會增強。DNA甲基化在植物中的研究已有大量報道，其中擬南芥的研究最深入，為其他作物的DNA甲基化研究提供了參考。

木薯（Manihot esculentaCrantz） 是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（MaihotP. Mill.）多年生植物，貯藏根淀粉含量在27%-34%之間，被譽為“淀粉之王”，是世界三大薯類作物之一，也是世界第六大糧食作物，具有重要的實用價值和經濟價值，為熱帶、亞熱帶近10億人口提供基本食糧，是我國重要的工業淀粉和生物質能源原料［7］。提高塊根淀粉含量，揭示淀粉合成機理是木薯研究的重點之一。DNA甲基化在植物生長發育過程中起著重要作用，本研究通過分析木薯塊根不同發育時期的基因組DNA甲基化變化情況，旨為木薯塊根淀粉合成機理提供表觀方面的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用生長于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質資源圃的華南5號（SC5）和Cas36-12兩個木薯（Manihot esculentaCrantz）種質。其中，SC5塊根淀粉含量較高，而Cas36-12的淀粉含量較低。SC5和Cas36-12種植于2016年3月，分別選取其形成期（植后4個月）、膨大期（植后7個月）及成熟期（植后10個月）塊根作為研究材料。每個材料每個生育期隨機選取3個塊根，洗干凈切成小塊混合保存于-80℃冰箱中，取 3個重復。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與甲基化敏感擴增多態性（MSAP）分析 木薯塊根總DNA采用TianGen植物基因組DNA提取試劑盒進行提取，提取方法參考說明書。MSAP分析中酶切、連接、預擴和選擴參照薛晶晶等［8］的方法分析，采用EcoRⅠ、MspⅠ和HpaⅡ作為限制性內切酶，雙酶切組合分別選用EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ（NEB），接頭和引物序列如表1所示。

表1 接頭和引物序列

1.2.2 微流控毛細管電泳系統檢測甲基化條帶 采用PerkinElmer公司的LabChip GX Touch 24微流控毛細管電泳系統，使用HT DNA 1K微流控芯片進行DNA甲基化條帶的分離，操作步驟參照DNA 1K Reagent Kit說明書進行。具體操作流程如下：

（1）芯片準備。使用前將芯片及試劑盒置于室溫20 min；制備膠-染料溶液（Gel-Dye），向 1管DNA Gel Matrix 中加入 13 μL DNA Dye Concentrate，旋渦混勻并將混合液轉入兩個帶有濾膜的離心管（Spin filters），室溫9 300 r/min離心7.5 min，丟棄濾膜，已過濾好的膠-染料混合液在4℃避光保存，可放置不超過三周。用去離子水分別清洗芯片上的孔1，3，4，7，8，10兩次。往孔3，7，8，10中加入50 μL Gel-Dye， 往 孔 4 中 加 入 50 μL 的 DNA Marker。用70%的異丙醇清潔芯片窗口的兩面，將芯片放入LabChip GX Touch儀器前確保孔1是空的。

（2）DNA ladder 和Buffer Tube準備。在0.2 mL Ladder Tube 中先后加入 108 μL 的 1X PCR buffer和 12 μL HT DNA ladder， 混勻 ；往 0.75 mL Buffer Tube中加入 750 μL 1X PCR Buffer；將 Ladder Tube，Buffer Tube分別放入LabChip GX Touch樣品板托架上的 ladder和buffer管槽中。

（3）DNA樣品的準備。將本研究獲得的選擴增 PCR 產物 20 μL 與 20 μL 1 X PCR buffer等 量 混合加入到96孔板中，并將96孔板置于LabChip GX Touch 樣品板上。

（4）按照儀器的操作說明進行儀器的運行。儀器運行結束后采用LabChip GX Reviewer 5.2分析軟件進行數據分析，將獲到的峰圖轉化為條帶，有峰位點“Yes”記為“1”，無峰位點“No”記為“0 ”。根據“1，0”統計結果，利用Excel分析其發育過程中的甲基化變化情況。

2 結果

2.1 SC5和Cas36-12不同發育期基因組DNA甲基化水平分析

本研究利用MSAP技術分析木薯SC5和Cas36-12的形成期、膨大期及成熟期的塊根基因組DNA 5'-CCGG位點胞嘧啶的甲基化水平和甲基化遺傳模式。MSAP方法的關鍵在于胞嘧啶的甲基化狀態會影響同裂酶HpaⅡ、MspⅠ的酶切反應，經PCR擴增出的多態性片段能夠反映該位點的甲基化狀態及程度（表2和表3）。因此，此方法被廣泛用于動植物基因組甲基化分析。

表2 SC5不同發育期的甲基化水平

表3 Cas36-12不同發育期的甲基化水平

利用E1、E2分別與HM1-HM7配對組成的14對選擇性引物對SC5、Cas36-12的形成期、膨大期及成熟期的塊根進行MSAP分析。結果顯示：SC5中共檢測到345個DNA甲基化位點，Cas36-12中共檢測到339個DNA甲基化位點。SC5中DNA甲基化水平（MSAPR%）隨著塊根的生長緩慢下降，由形成期的59.1%下降到成熟期的54.8%，全甲基化率（FMR%）呈現上升趨勢，由39.7%上升至45.8%，且膨大期與成熟期相同（表2，圖1）。而Cas36-12的MSAPR%和FMR%在膨大期時最大，達到49.3%和41.3%，至成熟期下降為48.7%和36.9%，但整體水平高于形成期的40.4%和34.2%（表3，圖1）。SC5整個發育期的MSAPR%和FMR%均比Cas36-12高，且兩個木薯品種在整個發育期的甲基化水平變化存在很大差異，推測可能與這兩個木薯品種的塊根淀粉含量差異巨大有關，且膨大期是整個塊根形成的關鍵期。

圖1 SC5、Cas36-12不同發育期塊根DNA甲基化水平變化

2.2 SC5和Cas36-12不同發育期甲基化狀態變化情況

甲基化狀態變化主要是指甲基化帶型的多態性變化，即SC5和Cas36-12塊根發育過程中的甲基化模式發生改變。將統計的多態性帶型分為3種類型，第一類（A-C）為不發生變化帶型，表明整個發育過程中，甲基化模式保持不變。第二類（D-I）為去甲基化類型，表明隨著塊根不斷生長，基因組DNA甲基化水平降低，其中 D、E、F為完全去甲基化，即所有被甲基化的胞嘧啶均發生去甲基化，G、H、I為部分去甲基化，即部分被甲基化的胞嘧啶發生去甲基化。第三類（J-O）為甲基化帶型，表明隨著塊根生長，基因組DNA甲基化水平升高，其中J、K、L為重新甲基化，即前一個生長期沒有甲基化，下一個生長期出現甲基化位點；M為全甲基化，即前一個生長期為單鏈外甲基化，下一個生長期變為雙鏈內甲基化；N、O為超甲基化，即在前一個生長期甲基化位點的基礎上，下一個生長期又有新的位點被甲基化（表4和表5）。

SC5塊根生長過程中，膨大期和成熟期不發生變化的甲基化狀態占49%和49.3%，分別有14.8%和15.7%的多態性帶型發生了去甲基化，25.5%和9.6%的多態性帶型發生了甲基化。其中，在整個發育過程中，全甲基化（0 1）帶型和半甲基化（1 0）帶型間沒有變化。第二類（去甲基化類型）中，從形成期到膨大期過程中，發生變化的甲基化模式主要以完全去甲基化為主；從膨大期到成熟期過程中，發生變化的甲基化模式主要以部分去甲基化為主。在第三類（甲基化類型）中，發生變化的甲基化模式主要以超甲基化為主。比較SC5塊根發育三個關鍵時期的甲基化變化情況，從形成期到膨大期，主要以發生甲基化為主；而從膨大期到成熟期，主要以去甲基化為主。

Cas36-12塊根生長過程中，膨大期和成熟期不發生變化的甲基化狀態占42.5%和47.5%，發生去甲基化的多態性帶型有13.3%和15.3%，發生甲基化的有24.5%和9.4%。其中，在整個發育過程中全甲基化（0 1）帶型和半甲基化（1 0）帶型間的轉變基本為0。第二類（去甲基化類型）中，膨大期與形成期相比，甲基化模式主要以完全去甲基化為主；而膨大期到成熟期的甲基化模式主要以部分去甲基化為主。第三類（甲基化類型）中，形成期到膨大期發生變化的甲基化模式主要以超甲基化為主，而膨大期到成熟期既有重新甲基化也有超甲基化的發生。比較Cas36-12塊根發育3個關鍵時期的甲基化變化情況，從形成期到膨大期，主要以發生甲基化為主；從膨大期到成熟期，主要以去甲基化為主。

比較SC5和Cas36-12塊根發育3個關鍵時期的甲基化變化情況，發現兩份材料甲基化變化的整體趨勢是一致的。形成期到膨大期主要以發生甲基化為主；而膨大期到成熟期，主要以去甲基化為主。推測在木薯生長過程中，基因組DNA的表觀修飾具有普遍規律性。

3 討論

真核生物中，表觀遺傳通過調控染色質構象進而影響基因表達來調控植物的發育，其調控機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和小RNA干擾等，在植物的生長發育過程中起著至關重要的作用。種子萌發、開花、植株生長、程序性死亡等不同生長階段、不同生長特性的植物DNA甲基化變化是不

同的。因此，研究不同植物不同生長狀態下的DNA甲基化變化對表觀遺傳學在植物中的功能都具有重要意義。研究表明：基因的甲基化會受轉錄水平影響，基因甲基化抑制基因表達，而基因的去甲基化會使轉錄水平增加［6］。而高等植物DNA甲基化在不同植物和組織中差異較大，一般基因組DNA有30%-50%的胞嘧啶處于甲基化狀態，大多數低于50%［9，10］。本研究以兩份淀粉含量差異較大的木薯品種（SC5和Cas36-12）的不同生長期的塊根作為實驗材料，分析其不同生長期的DNA甲基化水平，結果發現，SC5的DNA甲基化水平高于Cas36-12，且超過了50%，與茶樹［11］、牡丹［12］等的DNA甲基化水平相近，高于水稻［9］、擬南芥（35%-43%）［13］、棉花（41%）［10］等所報道的 DNA 甲基化水平。與Wang等［14］通過BS-seq測序對木薯與擬南芥的整體甲基化水平比較結果是一致的（木薯的甲基化水平高于擬南芥）。SC5和Cas36-12兩個品種的DNA甲基化水平在3個生長期的差異較大，與呂亞［15］對這兩個品種塊根代謝相關蛋白的表達趨勢是一致的，這可能和木薯基因組高度雜合的特性有關，與不同木薯品種塊根淀粉代謝機理有關。

表4 SC5生長過程中的DNA甲基化狀態變化情況

表5 Cas36-12生長過程中的DNA甲基化狀態變化情況

本研究采用的甲基化敏感擴增多態性（MSAP）技術是一種改良的AFLP技術，主要根據對甲基化敏感性不同的2種限制性內切酶HpaⅡ和MspⅠ對5'-CCGG-3'位點進行酶切，2 種酶均能識別并切割 CCGG 序列，但是 2 種酶對該位點的敏感性不同，可切割產生不同片段，通過擴增這些片段來揭示基因組的甲基化情況，是一種DNA甲基化檢測的經典方法。該方法優點是簡單易操作，使用方便，缺點是分辨率較低、假陽性較高且只能調查CCGG位點甲基化，獲得的甲基化位點數較少，未能覆蓋整個基因組，且選擇性引物的多少對獲得的甲基化位點也有一定影響。毛細管電泳（CE）具有高的分析效率、速度、微量、自動化和可定量等優勢。利用MSAP技術結合毛細管電泳分析木薯塊根的甲基化情況，可靠性較好。為了準確了解木薯塊根發育過程中的甲基化變化，本實驗下一步需要合成更多選擇性引物，來檢測其擴增結果，同時利用液相色譜法、亞硫酸鹽測序、免疫共沉淀等方法驗證。

4 結論

本研究采用MSAP技術結合CE分析SC5和Cas36-12的DNA甲基化水平。SC5的DNA甲基化水平高于Cas36-12，且超過了50%。SC5和Cas36-12塊根發育3個關鍵期的甲基化變化趨勢一致。形成期到膨大期主要以發生甲基化為主；而膨大期到成熟期，主要以去甲基化為主。

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